骨髓间充质干细胞分化图（骨髓干细胞分化图解）
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骨髓基质细胞和骨髓间充质干细胞的区别
骨髓基质细胞是存在于骨髓中的一类多能干细胞，具有分化成骨细胞、软骨细胞、细胞和其他几种结缔组织细胞（如腱细胞）。亦可转分化成心肌细胞和骨骼肌细胞。骨髓间充质干细胞现已被归为结缔组织成体干细胞。事实上，骨髓基质细胞中的间充质干细胞数量是很少的，约占细胞总数的10万分之一，其定向分化也不均一，现在越来越多的研究揭示骨髓间充质干细胞及其初步分化的祖细胞或称前体细胞(precusor,
progenitor
cells)具有一些特殊的表面蛋白特征；此外，干细胞具有多向分化及自我保湿补水抗衰老精华更新能力，其细胞复制分裂方式是不对称分裂，这明显不同于普通的细胞。通过贴壁法或Percoll等细胞分离介质只能获得混合的骨髓基质细胞，只有应用免疫磁珠、流式细胞仪等将其进一步分离纯化后，才能称为骨髓间质干细胞。（河南省干细胞库）
骨髓干细胞的骨髓间充质干细胞
MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我脐带干细胞可以治疗脑出血吗复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、 肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。骨髓间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，越来越受到学者们的青睐，被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。
骨髓间充质干细胞三系诱导分化技术
1.1 接种干细胞
取对数生长期的细胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的细胞密度接种至培养器皿，于37°C,5%CO2培养环境下培养至汇合度90~100%，弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液。NOTE:如细胞贴壁性较差，建议使用0.1%明胶对培养底面进行包被。
1.2 细胞分化诱导
于37°C, 5%CO2培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基维持液，培养1天后，再更换为成脂诱导分化培养基诱导液，继续培养3天。按照以上换液频率诱导14~21天,并注意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。
2. 染色鉴定
2.1 细胞固定
吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面,室温固定30~60min,弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。
2.2 油红0染色
取生理盐水或1xPBS与油红O原液配制油红0工作液(油红0原液:生理盐水=3:2)，现用现配。配制后可对油红0工作液进行离心，以沉淀染色液中的过饱和析出物。向清洗干净的诱导孔内加入适量油红0工作液,静置染色30min。吸走油红0工作液，用1xPBS清洗两次，并加入适量1xPBS避免细胞干燥。
2.3 诱导评估
显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，脂滴与油红0染料结合后呈现红色或橘红色。NOTE:干细胞的成脂分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。
1. 细胞分化诱导
将对数生长期的细胞消化下来计数，成软骨诱导分化培养基诱导液重悬细胞，离心后调整细胞密度密度1.0~2.0x 10e7cells/mL。吸取20 μl细胞悬液(约2.0~4.0x 10e5个细胞)悬滴至24孔板中央。置于37°C， 5%CO2培养环境下培养2~3 h使细胞贴壁。2~3 h后补充1 mL成软骨诱导分化培养基诱导液正常培养。每隔2~3天换液一次。按照以上换液频率诱导21~28天，并注意观察细胞形态变化。
2. 染色鉴定
2.1 细胞固定
吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去.后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~60min后，弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。
2.2 阿利辛蓝染色
向清洗干净的诱导孔内加入适量染色液，避光静置染色30min。吸去阿利辛蓝染色液，用1xPBS清洗两次,并加入适量1xPBS避免细胞干燥。
2.3 诱导评估
显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。
1. 干细胞的准备
将对数生长期的细胞消化下来计数，取3x 10e5个细胞转移到15mL离心管中，250g离心4 min。弃上清,加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基预混液，重悬细胞，150g 离心5min。小心弃去.上清，加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基诱导.液，重悬细胞，150 g离心5 min。将15 mL离心管的管盖稍稍旋开，放置于37°C，5% CO2培养环境下培养。
2. 细胞分化诱导
24h后观察细胞沉淀形变团聚的情况，如有明显的变化，则小心轻柔地拨动管底，尝试让细胞团脱离管底，全部浸润在诱导液中。
置于37°C, 5% CO2培养环境下培养约21天，通常每2天更换一次新鲜配制的成软骨诱导分化培养基诱导液。注意观察细胞团成球情况及表面光滑度，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。
3. 染色鉴定
3.1 软骨球固定
将软骨球从离心管中转移至EP管,并使用1xPBS清洗两次，最后置于适量的4%中性甲醛溶液中。
3.2 石蜡包埋切片
软骨球经石蜡包埋后切片。
3.3 阿利辛蓝染色
将石蜡切片脱蜡和脱水，使用阿利辛蓝染色液染色30 min，用自来水冲洗2 min,蒸馏水冲洗1次。
3.4 诱导评估
显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。
NOTE:干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异
1.1 明胶包被培养器皿
干细胞培养较长时间后，可能会出现脱壁卷边或漂浮现象，建议使用0.1%明胶溶液对培养器皿进行包被。准备合适的培养器皿，取适量明胶覆盖底面37°C静置30 min,吸取晾干即可使用。
1.2 接种干细胞
取对数生长期的细胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的细胞密度接种至包被后的培养器皿中,于37°C，5%CO2培养环境下培养至汇合度60~70%，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基。
1.3 细胞分化诱导
于37°C, 5%CO2培养环境下培养约14~21天，每2~3天换液一次，并注意观察细胞形态变化。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况,决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。
2. 染色鉴定
2.1 细胞固定
吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~ 60 min,弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。
2.2 茜素红染色
加入适量茜素红染色液染3~5 min,吸走茜素红染色液，用1xPBS清洗两次，并加入适量1xPBS避免细胞干燥。
2.3 诱导评估
显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，钙质结节与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。
NOTE:干细胞的成骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。
间充质干细胞的主要特性
间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有以下特性：
一、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。
二、具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应 ，从而发挥免疫重建的功能。
三、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。
四、面目模糊，表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。
正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在血液病治疗方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。
间充质干细胞的功能是什么?
间充质干细胞可以分化为骨、软骨、肌肉或肌腱，为临床治疗各种创伤提供细胞来源；间充质干细胞还可以分化为心肌组织，在显微镜下，能观察到心肌组织中的细胞株出现自发搏动；用间充质干细胞分化为真皮组织，可覆盖于烧伤创面。
鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。
骨髓间充质干细胞具有以下特性：
一、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、基质细胞等多种细胞的能力。
二、具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应 ，从而发挥免疫重建的功能。
三、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。
四、面目模糊，表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。
正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在血液病治疗方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。
以上内容参考百度百科-间充质干细胞
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