神经干细胞培养因子（神经细胞培养基）

本文目录一览：

• 1、获取神经干细胞有哪几个途径？
• 2、实验室小白篇：细胞培养用的液体
• 3、神经干细胞移植有什么神奇之处？
• 4、神经干细胞和神经生长因子这些能治疗吗？
• 5、何为神经干细胞
• 6、干细胞因子有用吗？

获取神经干细胞有哪几个途径？

而获取神经干细胞只有三个途径，一种是通过胚胎提取，也就是从流产的胎儿身上抽取获得干细胞；二是通过克隆，通过抽取动物的细胞注入卵母细胞，培植成干细胞；三则是从自身抽取骨髓，然后加入各种诱导因子，在进行一些基因的改造和修饰，定向诱导分化成神经干细胞。而前两种获取方式会带来伦理道德方面的置疑，而且从技术层面上来说难度也太大。所以从骨髓中进行神经干细胞的培养，不仅技术方面相对比较成熟，实验的效果和可靠性也比前两种要更明显。

后来应脑瘫、脑外伤和脑血管瘤三位志愿者患者的家属强烈要求，研究人员对他为什么禁止研究干细胞们进行了神经干细胞移植手术，疗效目前还正处于观察之中。如果一切顺利的话，不久之后就可以在临床中普通的推广应用了。

神经干细胞移植是国际上的一种研究方向，很多研究神经干细胞移植领域的专家、学者，对“神经干细胞移植”目前的研究的状况以及发展前景都抱有很大的期望，都希望在短时间内能有更大的突破。而对于发病率居高不下的偏瘫患者来说，如果神经干细胞移植获得突破并用于临床，实则算得上一项造福人类的研究成果。

实验室小白篇：细胞培养用的液体

一、细胞培养所需的培养液

在细胞的研究和利用过程中，最主要的是要为细胞提供最适的生长条件，保持细胞培养开始时的群体状态。这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规，而且细胞培养，试剂昂贵，费时、费力，不是随随便便就可以进行的。

细胞只有在最适生长条件下，才会保持正常的核型及功能。如果培养条件上打折扣，就意味着会出现带有染色体重排或突变变异株细胞。某些营养成分或生长因子用量不足或细胞高密度培养时间过长，都不是最适生长条件。

二、平衡盐溶液

平衡盐溶液具有维持渗透压、调节酸碱平衡的作用，同时可以供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。最常用于洗涤组织或细胞、配制培养用液的基础溶液是Hanks 溶液和磷酸缓冲盐溶液（简称PBS) 。

三、血清

血清中含有丰富的营养成分，包括多种生长因子及许多未知成分。动物细胞的生长都依赖血清。血清的种类很多，包括胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等。

选择一批最适于细胞的血清是很重要的，而且如有可能的话，应要求购买来源公司保留足量，以供应实验使用。这样可避免反复试用以选择最适血清所产生的费用。血清的质量可以通过检测细胞的克隆形成率来衡量。取对数生长期的细胞彻底消化后，以低密度（直径6mm 的平皿中加入约103个细胞）接种5~6 个平皿， 其中一个平皿中加入含30％血清的培养液，以测定高浓度血清的细胞毒作用。7~ 10d 后，出现肉眼可见的克隆时，倒掉培养液， 2％亚甲蓝染色2~5min,观察克隆形态、计算克隆形成率。克隆形成率一般为5%~ 10%。

四、抗生素

一般细胞培养时，抗生素不是必需添加成分。但一些特殊情况下培养液内需加入适量的抗生素，如怀疑有污染、原代培养时、新手操作不够熟练。常用的抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素。青霉素常用剂量为100U/ml ,链霉素常用剂量为100μg/ml。常配制成100 倍或200 倍， 分装为小包装， 于－20℃条件下保存。一次用一个小包装， 避免反复冻融 。

五、特殊的添加因子

特殊的添加因子可以使细胞培养的条件得到优化。原代培养细胞接种密度需适当提高，应尽可能用营养丰富的培养液，如使用胎牛血清。这些都属于一般优化条件。细胞培养条件优化的原则是：根据细胞类型， 模拟体内环境， 添加不同的细胞生长因子及有利于细胞生存、增殖的添加剂。表1 是常用的细胞培养添加成分。

表 1 常用的细胞培养添加成分

一种细胞生长因子常常是多种细胞的丝裂原，如碱性FGF, 不仅是成纤维细胞的丝裂原，还是内皮细胞、角质细胞、黑素瘤细胞的丝裂原。EGF 可促进上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞及平滑肌细胞等多种细胞的增殖。

培养干细胞时，常添加白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF ) ，又称分化抑制因子( DIA )， 是一种分泌型多肽，可抑制小鼠干细胞的自然分化。一般，可用纯化的LIF 直接加到培养液中，或使用用LIF表达载体转染过的饲养层细胞。正常的STO 细胞也可分泌。STO 细胞还分泌其他男士面部护理一般多少钱一次一些促干细胞生长的因子。目前，多数实验室仍使用饲养层细胞。重组的LIF 来源方便，与STO 细胞一起使用时，常用浓度为1000U/ml 。与小鼠胚胎成纤维细胞一起使用时，常用浓度为500U/ml 。

体外培养正常细胞需要使用不同生长因子的选择性组合。通常在已有的经典培养液配方基础上，添加不同因子而成。现在已有多种特定细胞培养液，且有商品供应，如血管内皮细胞培养液、神经干细胞培养液、骨髓干细胞培养液、间充质干细胞培养液、小鼠心肌细胞培养液(Claycomo Medium) 等。

六、消化液

细胞生长至一定密度时，需进行传代。消化液可使细胞脱离生长表面，离散成单个细胞。常用的消化液是0.25%、0.125％的胰蛋白酶和0.02％的二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 溶液，以无钙镁的PBS 或Hanks溶液配制。它们可单独使用，也可按一定比例混合后使用。大部分细胞的消化可使用终浓度为0.05%胰蛋白／0.02%EDTA混合液。有些上皮细胞贴壁力强，需较高浓度的胰蛋白酶(0.25%）或延长消化时间，甚至需要37°C温育。如果温育较长时间（超过20min)细胞仍不能脱壁，则应采取分步消化的措施，即将已脱壁细胞移出至离心管，加完全培养液中和胰蛋白酶的作用，对未脱壁的细胞再添加新胰蛋白酶再次消化。

七、细胞培养用的其他液体

细胞培养时，还会用到其他一些液体，如谷氨酰胺、HEPES 、丙酮酸钠、各种细胞生长因子、各种组织或细胞条件培养液，以及调整pH 使用的5.6%NaHCO3等。

谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，会导致细胞因生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故要适时添加。可配制200倍液体－20℃ 冰箱中保存，在使用前加入培养液内，终浓度为2mmoVL 。

HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2~7.4 范围内具有较好的缓冲能力，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠( 0.34g/L)共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。安全浓度范围10~25mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。一些生长缓慢的细胞加入，可明显改善细胞状态。通常配制200倍液，-20℃ 冰箱保存，在使用前加入培养液内终浓度为1mmol/L。

另外， 2－巯基乙醇(2-Mercaptoethanol, 2-Me) 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清， 有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA) 对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术。也开始用于一些难以培养的细胞。常用终浓度为5×10-5mol/L。常配制成0.1mol/L 的储存液，用时每升培养液加0.5ml 。

神经干细胞移植有什么神奇之处？

在生活中，有很多人因为一时不慎而落得终身瘫痪的后果，给自身和家人都带来巨大的痛苦。如果说不久的未来，发达的医学就能够通过移植神经干细胞的手术，有希望让长期坐在轮椅上的张海迪、桑兰重新站立起来，你会相信吗？

也许又有人会对此提出疑问，已经瘫痪了那么久的人真的还能重新站起来吗？不用怀疑，确实有可能。对于移植神经干细胞能够创造出神奇的效果，是全军神经医学研究所所长、珠江医院神经外科的主任徐如祥教授通过不断研究之后再一次研讨会上透露给外界的。

也许很多人并不知道神经干细胞移植是怎么一回事，因为就目前来说这个领域对大部分的人来说还十分陌生，但是它在世界上已经有了一定的发展。神经干细胞移植是国际医学界的一个前沿学科，研究前景十分看好。

在人的大脑内发现神经干细胞距离现在只有十多年的时间，由于神经干细胞在临床应用方面具有很广泛的前景，所以全世界现在几乎都在把它作为一个热点来进行研究。神经干细胞的研究领域，不管是从技术上来说还是临床应用，目前所处的都是比较前沿的位置。

传统观念一直以来都认为，中枢神经系统的细胞在出生前或者出生以后就会停止生长，这就意味着人类或者高级的哺乳动物在成年以后，神经细胞就会不断的减少而且不能被更新或者代替，而对于后天发生的中枢神经系统损伤是无法进行修复的，神经功能的恢复只能依靠其附近或者其他部位的中枢结构来代偿。但是，后来却有研究者发现，成年的哺乳动物脑内一些部位的细胞具有再生的功能，而人脑内也同样存在这样的细胞，也就是我精准抗衰中心们现在所说的神经干细胞。

据有关的研究专家介绍，只要抽取一点患者的骨髓，并在体外培养并诱导成神经干细胞，然后再移植入患者的神经系统，从而使受损的神经功能得到修复。一旦这项研究能够在临床上获得成功，那些脑外伤、偏瘫、脊髓损伤等神经功能受损的患者，尤其是对植物人来说，实在不失为一个福音。

但是神经干细胞移植的早期研究通常只能以动物活体来做实验。实验之前，研究人员会先用来做实验的白鼠第8、9根胸椎之间的神经完全切断，使其后腿失去自主移动的功能，也不能自动排尿，这只白鼠就相当于是一个高位截瘫的病人。接着，研究者用从人体胚胎中分离出来的神经干细胞，加入各种诱导因子，并在试管中培养了近9个月，干细胞指数一直呈现增殖状态，研究者终于克服了人体胚胎干细胞在体外一段时间后容易分化或者凋亡的这一难题。而后研究人员会将人胚干细胞移植于高位截瘫的白鼠体内，不久之后，研究人员就惊奇地发现白鼠的后腿开始逐渐恢复运动功能，逐渐的已经能够自主支撑身重、缓慢的移动和爬坡，并开始自动排尿。经过更深入的检查证实，神经干细胞在白鼠体内的存活状况良好，装逐渐的向病变部位迁移并分化成熟的细胞。白鼠脊髓损伤处的神经细胞正处于明显的再生过程，而且没有出现明显的排异反应。一旦时机成熟，研究人员就将着手进行神经干细胞移植的临床治疗研究。

神经干细胞移植已经是国内外医学学术界公认的修复神经功能受损最有效方法。而获取神经干细胞只有三个途径，一种是通过胚胎提取，也就是从流产的胎儿身上抽取获得干细胞；二是通过克隆，通过抽取动物的细胞注入卵母细胞，培植成干细胞；三则是从自身抽取骨髓，然后加入各种诱导因子，在进行一些基因的改造和修饰，定向诱导分化成神经干细胞。而前两种获取方式会带来伦理道德方面的置疑，而且从技术层面上来说难度也太大。所以从骨髓中进行神经干细胞的培养，不仅技术方面相对比较成熟，实验的效果和可靠性也比前两种要更明显。

后来应脑瘫、脑外伤和脑血管瘤三位志愿者患者的家属强烈要求，研究人员对他们进行了神经干细胞移植手术，疗效目前还正处于观察之中。如果一切顺利的话，不久之后就可以在临床中普通的推广应用了。

神经干细胞移植是国际上的一种研究方向，很多研究神经干细胞移植领域的专家、学者，对“神经干细胞移植”目前的研究的状况以及发展前景都抱有很大的期望，都希望在短时间内能有更大的突破。而对于发病率居高不下的偏瘫患者来说，如果神经干细胞移植获得突破并用于临床，实则算得上一项造福人类的研究成果。

神经干细胞和神经生长因子这些能治疗吗？

怎么说呢，疗效应该不是很好，干细胞和 神经生长因子目前还是处于研究阶段，是医学的前沿学科，但距离应用临床还有很大的距离，目前我觉得你应该没什么大问题，没听说还有这样定时感到不适的，是不是你的心里作用呀，你可以工作，可以思考，运动正常，为什么老是想着自己有病呢，再说你的这些症状和脑干一点关系也没有，所以你不要太过于紧张，快乐的享受生活吧

何为神经干细胞

一、神经系统发育与神经干细胞

神经系统的发育起始于胚胎早期的神经管和神经嵴，其中央管在发育的终末形成脑室系统和脊髓的中央管，管腔内面被覆的细胞为神经上皮(neuroepithelium)，具有活跃的增殖和分化能力，在胚胎早期此区域称为脑室／脑室下区(ventricular/subventricular zone，VZ／SVZ)，而在成年后则称为室管膜／室管膜下区(ependymal/subepen-dymal zone，EZ／SEZ)，在神经发生(neurogenesis)过程中起着举足轻重的作用。

有关神经元和神经胶质细胞的起源，长期以来一直存在着争议，目前被大多数神经生物学家接受的是“一元论”的发生机制，即神经元和胶质细胞来源于共同的干细胞。这种干细胞由胚胎早期室管膜上皮细胞产生并具有多向分化的潜能，因此被称为多潜能神经干细胞(multipotential neural stem cell)，迄今为止，多潜能干细胞的概念仍不十分确切，因此命名也尚未统一，有的学者也称之为前体细胞(precursor cell)或祖细胞(progenitor cell)，总之，代表具有下述特性的一类细胞：(1)可自我复制或更新(self-renew)，产生与自己相同的子代细胞，维持稳定的细胞储备；(2)处于较原始的未分化状态，无相应成熟细胞的特异性标志；(3)具有多向分化的潜能，即演变成不同成熟细胞类型的能力。

Lendahl等通过实验证明中枢神经系统内多潜能干细胞或前体细胞在胞浆内表达一种被称为巢蛋白或巢素(nestin)特异性蛋白，现已证实其属于中间丝(intermediate filament)蛋白家族，只在多潜能的神经外胚层细胞表达，随着神经上皮的分化成熟逐渐消失，其功能现在尚未完全明确，可能与其它家族成员相似，同时具有结构和信息传递的功能；通过检测巢蛋白的表达即可确定多潜能干细胞的存在。另外，利用分子水平的细胞谱系追踪技术，通过脑室内注射表达荧光蛋白或b-半乳糖苷酶(LacZ)的逆转录病毒感染SVZ区处于分裂期的细胞，可以对干细胞的增殖、移行和分化过程进行监视。通过上述方法，目前已经证实在成年哺乳类动物中枢神经系统内至少有两个区域存在着具有增殖能力的细胞，即室下区和海马结构齿状回的颗粒细胞层下区(subgranular zone，SGZ)。这两个区域原始细胞的表型目前还不清楚。

二、神经干细胞的研究方法

1.体外研究 常规分离神经干细胞的方法是在活体动物脑内已经确定有细胞分裂的部位切取部分组织，在含有高浓度的致有丝分裂原的培养基中孵育，经过增殖后，诱导细胞向不同的子代细胞分化。分化的鉴定通过在单细胞形成子代克隆中，应用免疫细胞化学染色方法检测神经元、星形细胞、及少突胶质细胞所表达的特异性抗原。

定义一组体外培养的细胞为多潜能干细胞也存在着许多问题，其中最重要的是必须证明这些细胞具有向不同成熟细胞分化的能力。虽然现在完全可以应用特异性抗体标记神经元、星形细胞或少突胶质细胞，但是神经元的种类有数百种，若证明真正意义上的“多潜能”尚有很多的工作要做。

目前国外一些研究机构相继报道了建立干细胞系的工作，与原代培养相比，为体外观察和移植研究提供了较稳定的材料；但是应用病毒或v-myc等癌基因修饰的“永生化细胞”遗传特性改变并有继续突变的趋势，可能在移植后生成肿瘤或在分析正常基因对子代细胞分化方向时产生影响，因而其应用价值有待于进一步评价。

2.在体研究 神经元与神经胶质细胞分化的研究主要通过追踪干细胞分裂、分化后产生的细胞谱系构图(lineage

mapping)进而了解细胞发育间的“亲缘”关系。通常认为细胞发育是由其祖先和环境因素共同决定，即受细胞内外调节因素的共同调控。为进一步确定经体外培养鉴定的干细胞的分化潜能，将扩增后／或经基因修饰的干细胞移植到脑内进行观察，结果证明植入的细胞不仅可以在发育期脑和周围神经系统中广泛移行，而且向神经元和胶质细胞分化，甚至人胚胎来源的干细胞在植入成年大鼠脑内也可以分化成为神经元和胶质细胞；同时发现移植细胞分化方向似乎由其所处的局部环境而非内在的特性决定，胚胎来源的干细胞沿着宿主细胞移行并分化成为移植部位的特殊细胞类型，植入的细胞在正常发育的脑内对局部信号的适宜反应导致了这种“嵌合”现象，使其与宿主细胞很难区别。Rosario等将培养的干细胞植入基因突变致小脑前叶发育缺如的小鼠模型，发现这些细胞逐渐分化成颗粒细胞并形成小脑的内颗粒层；电子显微镜观察结果显示供体细胞分化而来的颗粒细胞与宿主苔藓纤维建立了突触联系。上述这种显著的可塑性并不局限在发育期脑内，从成年动物海马来源的干细胞也可以在植入海马后分化成为神经元和胶质细胞，与齿状回正常分化的细胞类型相似；更进一步，这些细胞在植入RMS(rostral migratory

stream)后还可以分化为嗅球神经元并具有合成酪氨酸羟化酶的能力，这种酶在正常海马细胞内是不能合成的；而在移植到成年动物正常情况下不产生神经元的部位，干细胞则不能生成神经元而是向胶质细胞分化。最令人惊讶的是Bjornson等报道从胚胎或成年小鼠脑内取得的细胞经标记后移植到放射损伤的宿主鼠体内，竟然分化为骨髓细胞、淋巴细胞以及其它原始的造血细胞，其结果提示神经干细胞的分化潜能不只局限于神经系统。在受损伤的发育期脑内，干细胞则向损伤部位移行并替代缺失的细胞。由此推测，植入的细胞在分裂增殖的同时，可能“辨别”其所处的环境，但是什么因素始动分化并决定其分化方向还有待于进一步探索，其中必然交杂着内外因素的复杂作用，供体细胞本身所具有的内在分化程序、局部环境中的神经营养因子、细胞外基质、黏附分子及细胞间的相互作用均可能参与其中。

3.影响神经干细胞增殖分化的因子 在多细胞有机体内，每一个细胞的活动均受到极其复杂的内、外环境信号之间相互作用的调控，其中生长因子可能是涉及此过程中的主要信号分子。中枢神经系统中的各种因子对发育期细胞的存活、增殖、移行和分化，成年时期功能的维持，损伤时细胞的可塑性改变，都有着非常重要的影响。其中研究中应用最多的生长因子是EGF和bFGF，已知EGF是星形胶质细胞的致有丝分裂原，在体外细胞培养中也可以促进神经存活和突起生长，Weiss等证明其对培养的干细胞有明显的刺激增殖作用，其子代细胞可向神经元、星形细胞和少突胶质细胞分化。bFGF据报道也具有相同的作用，而且在低浓度下尚有诱导干细胞向神经元分化的作用。当EGF和bFGF注射入成年鼠脑室内，EGF可强烈刺激SVZ细胞增殖，对SGZ的细胞则无作用；bFGF的作用相对较弱；但是新生鼠通过注射bFGF则可导致脑内神经元的数目增多。已经检测具有相类似作用的还有神经生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子、神经营养因子等，但是它们的作用机制仍不清楚。

三、神经干细胞的应用前景

1.细胞移植 以往脑内移植或神经组织移植研究进展缓慢，主要受到胚胎脑组织的来源、数量以及社会法律和伦理等方面的限制。神经干细胞的存在、分离和培养成功，尤其是神经干细胞系的建立可以无限地提供神经元和胶质细胞，解决了胎脑移植数量不足的问题，同时避免了伦理学方面的争论，为损伤后进行替代治疗提供了充足的材料。研究表明，干细胞不仅有很强的增殖能力，而且尚有潜在的迁移能力，这一点为治疗脑内因代谢障碍而引起的广泛细胞受损提供了理论依据，借助于它们的迁移能力，可以避免多点移植带来的附加损伤。另外，神经干细胞移植也为研究神经系统发育及可塑性的实验研究提供了观察手段，前文提及细胞因子参与调控神经元增殖和分化，通过移植的手段对这些因素的具体作用形式和机制进行探索，为进一步临床应用提供了理论基础。

2.基因治疗 目前诱导干细胞向具有合成某些特异性递质能力的神经元分化尚未找到成熟的方法，利用基因工程修饰体外培养的干细胞是这一领域的又一重大进展；另外已经发现许多细胞因子可以调节发育期甚至成熟神经系统的可塑性和结构的完整性，将编码这些递质或因子的基因导入干细胞，移植后可以在局部表达，同时达到细胞替代和基因治疗的作用。

3.自体干细胞分化诱导 移植免疫至今为止仍是器官或组织移植的首要问题。前文提到已经证明成年动物或人脑内、脊髓内存在着具有多向分化潜能的干细胞，那么使人们很容易想到通过自体干细胞诱导来完成损伤的修复。中枢神经系统损伤后，首先反应的是胶质细胞，在某些因子的作用下快速分裂增殖，形成胶质瘢。其实在这个过程中也有干细胞的参与，可不幸的是大多数干细胞增殖后分化为胶质细胞，什么机制控制着细胞的分化决定，确切机制尚未明了。一旦这个机制被发现，无疑对中枢神经系统损伤修复来讲是一个重大的飞跃，因为它不仅可以避免移植造成的不必要损伤，更重要的是可以避免排斥反应。体外实验已经证明某些因素的诱导分化作用，但是应用到临床尚有一段距离，可我们仍从前述成功的探索中看到希望并相信在这方面的突破即将到来。

干细胞因子有用吗？

干细胞因子，是干细胞来源的永生细胞系在干细胞增殖分化过程中所分泌的，包含了生长因子、蛋白质、活性多肽、微量元素等多种促进细胞生长、活化、再生等的物质。

其中包括：

肝细胞生长因子（HGF）——促进肝实质细胞等各组织细胞的增殖。

神经细胞生长因子（NGF）——促进神经细胞（知觉、交感神经节细胞）的增殖。

上皮细胞生长因子（EGF）——皮肤、肺、角膜、气管上皮细胞的增殖。

成纤维细胞生长因子（FGF）——促进人成纤维细胞、胶质细胞、血管内皮细胞的增殖。

胰岛素样生长因子（IGF）——软骨细胞、平滑肌细胞的增殖。

集落形成刺激因子（CSF）——负责免疫细胞的粒细胞、巨噬细胞等干细胞的增殖。

各类白介素（LL-1-19）——促进免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）

以及胸腺细胞的增殖、分化，促进淋巴细胞活素产生。

口服干细胞，大家印象中就是个骗局。但口服干细胞因子，可以从细胞层面上调理人的身体，从而全面提高人体机能，改善亚健康，加固免疫防御系统，使人体保持年轻、健康、活力状态。