免疫细胞分离和检测原理（免疫细胞分离的方法及原理）

免疫组化实验原理(Vector kit)

    首先来谈一下免疫组织化学（IHC, Immunohistochemistry）、免疫细胞化学（ICC, Immunocytochemistry）和免疫荧光(IF, immunofluorescence technic )的脸上敏感肌如何护理的简单介绍共通之处和区别。

    平常说的什么是抗衰落技术 免疫组化 就是用石蜡切片做的免疫组织化学，样品是经过甲醇或甲醛固定后脱水包埋得到的组织切片。加入一抗二抗，经DAB底物显色，用普通的显微镜观察信号分布和强度。专业一点，免疫组化包括免疫组织化学和免疫细胞化学，即IHC和ICC。ICC与IHC的区别在于样品的不同，ICC的样品是细胞（提前制作的细胞爬片），并且常用荧光染色检测，也可以用酶联抗体显色，最后分别用荧光显微镜和普通光学显微镜观察和拍照。IF技术所用的样品范围广，可以用石蜡切片、冰冻切片，也可以用细胞爬片。而IHC多用石蜡切片，因为石蜡切片能保持完整的组织型态和蛋白表达位置，样本可大可小。冰冻切片由于不需要经过固定、脱水和修复等过程，蛋白的结构保持地更好一些，步骤也更简单快捷，是术中病理诊断的常用技术。用IF做ICC和冰冻切片的染色，过程类似。

IHC、ICC和IF的原理有相似之处，本质上都是利用了酵母菌细胞结构示意图初中抗原抗体的特异性结合。IHC和ICC中的“化学”，顾名思义，是通过化学反应显色。IF中的“荧光”是通过荧光基团被相应的激发光激发而发光，从而被检测到。不同之处在于，IHC和ICC是通过在二抗上偶联HRP（辣根过氧化物酶），以过氧化氢为底物，产生游离氧，后者使无色的供氢体DAB氧化为棕褐色沉淀定位于过氧化物酶所在部位。而IF则是在二抗上偶联荧光基团，在相应波长的激光激发下而发出荧光（是荧光染料的特性）。因此，前者用普通的光学显微镜即可观察到，而后者需要用荧光显微镜。可以根据自己的实验目的去选择不同的显微镜，如果只是简单的定位，要求可以低一些，如果需要做准确一点的定位和定量，需要更高分辨率的显微镜。

    我的课题做IHC和多标（mIHC）较多，故而，我会对IHC的讲解更加细致一些。

    肝脏组织固定收其中的两个中等大小的肝叶，用4%多聚甲醛的固定过夜（16~18h）。甲醛使组织中的蛋白交联，将组织形态固定住，同时使组织更致密且硬度增大。1xPBS洗三遍之后进行脱水，从75%EtOH开始，一般2~3h即可，如果当天来不及脱水（全程约10h），便可以在75%乙醇中过夜，甚至放一周也没问题。从75%-85%-95%-100%EtOH梯度脱水，是为了防止组织快速收缩，改变了组织形态，使得信号不容易被检测到。由于最后要用石蜡包埋，且组织内部和周边的石蜡最好达到均质的状态，才会利于切出完整的组织切片，而且100%乙醇与石蜡不互溶，二甲苯是石蜡的溶剂，所以不能直接通过乙醇直接浸入石蜡，而需要用二甲苯替换出组织中的无水乙醇，最后浸入石蜡中过夜，让石蜡充分进入组织。切片时选择5um的厚度，37℃展片和烘片。其实不必执着于时间，展片的标准应该是切片完全展开没有褶皱，并且石蜡不能融化，注意贴片时的手法，一般来说没有什么问题。烘片的目的是让组织与玻片完整贴合固定，并且烘干表面和周围的水，一般来说过夜后第二天收起来就可以了，四度保存。

    下面说一下IHC染色的问题。

    做过IHC的朋友都知道，这个实验很耗时间，一做就是两天，其中大部分时间都是零零散散，最重要的工作莫过于等待。个人认为做IHC的关键点在于：洗干净和二抗的孵育时间。如果洗不干净或者二抗孵育时间过长，肯定会造成非特异性染色，也就是背景，导致染色质量很差，甚至忙活几天都不能拿到具有分析价值的结果。我们做肝脏切片，用5%NGS（normal goat serum）封闭时间可以长一些（如果中间有事情），但最少一个小时。二抗的孵育时间是30min，AB complex（avidin+biotin）的孵育时间也是30min。由于二抗和avidin孵育时间长的情况下，会有非特异性染色，具体的原理，在后面介绍avidin+biotin的时候再细讲。我们实验室是固定DAB的显色时间是5min，根据信号强度来调整一抗的浓度。当然也可以摸DAB的显色时间，但个人觉得不太好把控。因为抗体的适合浓度是一个较大的范围，而DAB的显色时间很短。

    用单蒸水和1xTBST洗片子最好放在摇床上摇洗，会减少背景，亲测管用。再有一点就是画阻水圈，不要画太粗太细，更不要画地太靠近组织，否则滴加的极性试剂遇到油性阻水圈形成的液面会变高，导致组织边缘接触不到试剂而变干，从而有很高的背景。

    IHC整个过程除了洗，我们加的试剂有SP6000（vector）、5%NGS（goat）、Avidin、Biotin、一抗、二抗、A+B complex、DAB。下面说一下试剂的作用原理。SP6000是Vector公司出的试剂，用于封闭内源性的过氧化氢酶。由于二抗后面偶联的HRP就是一种过氧化氢酶，如果内源性过氧化氢酶太多，会造成非特异性着色。5%NGS是为了封闭内源蛋白，因为二抗对于一抗的识别是由于Fc片段，如果其他蛋白也有Fc片段同样会被识别，从而造成非特异性着色。在这里应该想到做western blot时用5%脱脂乳粉封闭，原因之一是为了将NC膜或PVDF膜上的未能结合蛋白的孔隙封闭住，防止二抗结合到孔内造成背景色，原因之二就是封闭其他的可能会与一抗结和的杂蛋白。血清的来源只要与一抗的来源不一样即可，goat和bovin都可以，因为一抗来源常见的无非是mouse或rabbit，选择一个通用的更便于实验。我们实验室做肝癌，肝脏细胞中有大量的内源性生物素（Biotin），由于二抗之后需要avidin-biotin-HRP的信号放大过程，前面需要加入外源的avidin封闭内源性的biotin（Avidin-Biotin高亲和）。由于Biotin是羧化酶的辅因子，Biotin会结合到酶的特殊位点上帮助酶发挥催化作用，再加入Biotin去封闭酶上的biotin的结合位点，在孵育AB complex的过程中才不会导致过量的biotin结合到酶的位点上，造成非特异性信号。WB的二抗上面直接偶联HRP，而IHC的二抗上面通过偶联Biotin的亚基，利用biotin和avidin的高亲和力来提高HRP的量，从而放大信号。二抗上面偶联HRP的量很少，而一抗结合二抗的数量有限。一个二抗结合一个biotin，一个biotin连接一个avidin，而一个avidin可以有四个基团连接biotin，于是达到了信号放大的目的。

    明确实验原理不等于能做好实验，个人认为实验习惯非常重要，不仅要心明眼亮，更要手稳，才能重复出来高质量的实验结果。

    后面会出一篇多标染色和一篇avidin-biotin的结合原理，敬请期待！

细胞免疫治疗的原理是什么？

免疫细胞的治疗是指把病人的细胞从血里面分离出来，在体外用一些细胞因子，使它变成一种杀伤细胞，再回输到血液中去，这种杀伤细胞可以识别肿瘤细胞进行杀伤。免疫治疗是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。免疫抗癌药物“依维卡”是依靠皮卡免疫技术平台研发的创新类免疫大分子药物，属一类治疗用生物制品，这也是皮卡免疫技术平台推出的第三个进入临床开发阶段的大分子免疫生物制品。

简述主要免疫细胞分离方法和分离原理？

免疫磁珠法分离细胞原理：

免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。

免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：

阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞

阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞

一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。

BD™ Imag 磁珠：

· 大小在0.1－0.45mm

· 包被了BD Pharmingen生产的高质量单抗

· 磁珠已为白细胞亚群的阳性和阴性分离法所优化

· 用于BD™ IMagnet direct magnet

将包被了特异性单抗的BD IMag磁珠加入细胞悬液，磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合，通过BD™ IMagnet direct magnet分离得到的连有BD IMag磁珠的细胞可直接用于功能试验和用流式细胞仪检测。

缺点：

• 对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养

• 纯度低

• 容易阻塞FCM的喷嘴

BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分离系统的优点，开发出直径约200nm中等大小磁珠。

• 技术简单，分离在普通的试管中完成

• 易于增大细胞用量

• 对细胞温和，不影响细胞功能及其分离后培养，可直接上流式

• 纯度高，回收率高

• 成本低

此外，Mouse lineage panel中biotin标记的抗体还可用于FCM分析细胞表面抗原，以及进行细胞/组织免疫荧光实验。

BD提供2种免疫磁珠：

· 包被了针对白细胞亚群的单抗的磁珠

· 包被了链霉亲和素（streptavidin）的磁珠：此种情况下，在实验系统中加入生物素标记的单抗，磁珠通过streptavidin与生物素标记的单抗结合，单抗与细胞表面相应抗原特异性结合而使细胞被磁珠间接捕获，从而达到分离。这种磁珠使研究者可根据自己需要选择生物素标记的各种单抗去分离目的细胞，应用范围更广泛，使用更灵活。

不同物种磁珠分离试剂

人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；

小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.

ë 利用Streptavidin连接的磁珠，只需选配biotin标记的所需单抗,就能分离更多种类细胞

新货聚焦：

现在，BD PMG又推出用于分离小鼠造血干细胞/祖细胞的新试剂mouse lineage panel。

其中包括5种biotin标记单抗，这些单抗能结合小鼠造血细胞的主要分化系细胞: T、B淋巴细胞，单核/巨噬细胞，粒细胞和红细胞。将这组试剂与Streptavidin Plus BD™ IMag Particles (557812) 联合使用，就能通过免疫磁性分离法去除小鼠骨髓造血细胞的主要分化系细胞，从而富集到造血干细胞和祖细胞（阴性片断）。

Mouse Lineage Panel（559971）：（5×2ml/vial） 可分离109 Mouse骨髓细胞

1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain)；

2) Biotin-anti-mouse CD11b；

3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220；

4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1)；

5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76)

磁分离细胞的重要指标是：

纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。

目前市场上有2种磁性细胞分离系统：

* Small particles (≈50 nm) － MACS

* Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）

小磁珠 优点：

• 对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养

• 可直接上流式检测，不影响散射光

缺点：

• 需要很强的磁场来分离细胞

• 分离速度很慢，得率不高

• 需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行

• 成本昂贵

大磁珠

• 技术简单，分离可在试管中完成

• 易于增减细胞用量

• 速度快，得率高

• 成本低

免疫细胞分类及分离方法

免疫细胞的分类有：

T细胞

B细胞

NK细胞

巨噬细胞

树突状细胞

非造血细胞

一、白细胞的分离 自然沉降法 聚合物加速沉淀法

二、淋巴细胞 粘附贴壁法 吸附柱过滤法 磁铁吸引法

三、吞噬细胞 percoll分离法

免疫细胞分类及分离方法是什么？

免疫细胞（immune cell）主要是指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛泛，主要是T、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单该吞噬细胞系统的细胞。免疫细胞分离技术

1、淋巴细胞的分离

取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1 淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min 水平离心20min，管内分为4 层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks 液洗两次，每次2000r／min 离心10min，最后用RPMI l640 培养液将细胞配成2×106／m1 的细胞悬液备用。

2、T 细胞及B 细胞的分离

将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B 细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMI l640 培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T 细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B 细胞，并用少量的RPMI l640 培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B 细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。

3、CD4 细胞及CD8 细胞的分离

（1）CD4 细胞的分离：将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC—10 柱，然后用少量的RPMll640 培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4 细胞。

（2）CD8 细胞分离：用Tris 缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS 洗净。然后将已标记有抗CD8 单克隆抗体的T 细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1 加入上述的平皿内，4℃放置2 小时，用PBS 轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS 吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。CD4 细胞亦可用此法分离。

4、单核巨噬细胞的分离

单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C02 温箱内温育1 小时，然后用RPMI 1640 培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。

细胞免疫的原理机制

同体液免疫一样，细胞免疫的产生也分为感应、反应和效应三个阶段。其作用机制包括两个方面：⑴致敏T细胞的直接杀伤作用。当致敏T细胞与带有相应抗原的靶细胞再次接触时，两者发生特异性结合，产生刺激作用，使靶细胞膜通透性发生改变，引起靶细胞内渗透压改变，靶细胞肿胀、溶解以致死亡。致敏T细胞在杀伤靶细胞过程中，本身未受伤害，可重新攻击其他靶细胞。参与这种作用的致敏T细胞，称为杀伤T细胞。⑵通过淋巴因子相互配合、协同杀伤靶细胞。如皮肤反应因子可使血管通透性增高，使吞噬细胞易于从血管内游出；巨噬细胞趋化因子可招引相应的免疫细胞向抗原所在部位集中，以利于对抗原进行吞噬、杀伤、清除等。由于各种淋巴因子的协同作用，扩大了免疫效果，达到清除抗原异物的目的。

在抗感染免疫中，细胞免疫主要参与对胞内寄生的病原微生物的免疫应答及对肿瘤细胞的免疫应答，参与迟发型变态反应和自身免疫病的形成，参与移植排斥反应及对体液免疫的调节。也可以说，在抗感染免疫中，细胞免疫既是抗感染免疫的主要力量，参与免疫防护；又是导致免疫病理的重要因素。

T细胞是细胞免疫的主要细胞。其免疫源一般为：寄生原生动物、真菌、外来的细胞团块（eg：移植器官或被病毒感染的自身细胞）。细胞免疫也有记忆功能。