免疫细胞化学实验（免疫细胞化学实验结果阴性的可能原因）

如何做好免疫细胞化学实验

载玻片/盖玻片处理

聚醚酰亚胺或多聚赖氨酸在室温下包被盖玻片1小时。

无菌水冲洗盖玻片（3次 ，每次5分钟）。

可将盖玻片干完全干燥，并在紫外光下消毒至少4小时。

在玻片上种植细胞，或准备细胞离心涂片器，或做好涂抹准备。

磷酸盐缓冲液（ PBS ）进行简短的干细胞一般多长时间注射一次冲洗。

第一步：细胞固定

用预冷的甲醇、丙酮（ 1-10分钟），或3-4 ％甲醛（PBS的pH值7.4）室温（或者-20 ℃)固定细胞片15分钟。

用预冷的PBS冲洗细胞片两次。透化：如果目的蛋白是免疫细胞生成或成熟的地方胞内表达，透化细胞非常重要。注：丙酮固定标本不需要透化。

用含0.25% Triton X-100或100 μM 洋地黄皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室温孵育标本10分钟。Triton X - 100是目前最流行的通透剂，可提高抗体的渗透程度。但这不适合与膜相连抗原的使用，因为它会将膜破坏。

PBS清洗细胞片3次，每次5分钟。

第二步：封闭和孵育

PBST孵育细胞（1 ％牛血清白蛋白），室温30分钟，以封闭抗体非特异性结合位点（封闭液也可以是1 ％明胶或10 ％的血清，此血清需来自二抗产生的物种体内） 。

加入一抗在湿盒内孵育细胞片（在使用含1% BSA PBST稀释抗体的），室温1小时或4 ℃过夜。

缓慢倒出溶液，PBS清洗细胞片的3次，每次5分钟。

加入含1 ％BSA的二抗稀释液，室温避光孵育1小时（避光）。

缓慢倒出二抗溶液，PBS清洗3次，每次5分钟（避光）。

第三步：复染

在0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA染液)下孵育细胞1分钟。

PBS清洗。

第四步：封片和观察

滴加一滴封片剂封片剂质，盖上盖玻片。

用指甲油密封盖玻片，以防止干燥和显微镜观察时移动。

观察后的细胞片可避光保存在-20或4°C。

免疫细胞化学技术的标本的制备

· 标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件

· 免疫组化对组织和细胞标本的要求

– 保持所检标本原有的结构、形态；

– 在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。

· 免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。

– 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。

免疫组化中常用的组织和细胞标本

· 组织标本

– 石蜡切片

– 冰冻切片

· 细胞标本

– 组织印片

– 细胞培养片(细胞爬片)

– 细胞涂片 · 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法

– 最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；

– 石蜡块还能长期存档，供回顾研究。

· 石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。

1、取材的特殊要求及注意事项

· 标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。

· 取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。

– 细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。

1、取材的特殊要求及注意事项(续)

· 避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；

– 镊取组织动作要轻；

– 经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。

2、固定及常用的固定液

· 取材后的组织需立刻投于固定剂中

– 固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；

– 对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

· 常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。

– 醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）

– 醇类（常用乙醇）

– 其它 （丙酮）

(1) 醛类

· 甲醛(福尔马林)应用最广

– 原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。

– 优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。

– 缺点：

· 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；

· 醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；

· 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

– 注意事项：

· 缩短固定时间，降低固定温度(4C)，为此组织块不宜过厚。

· 改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液，减少固定液pH的变化。

· 固定后充分水洗以减少分子间交联。

· 切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

· 戊二醛：

– 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

· 多聚甲醛(常用4%)：

– 可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。

· 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

(2) 醇类

· 最常用的醇类固定剂是乙醇。

– 其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。

– 优点：穿透性强、抗原性保存好。

– 缺点：

· 脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。

· 乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

(3) 其它固定剂

· 丙酮：

– 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。

3、抗原修复——原因

· 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：

– 抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了严重掉头发是什么原因引起的女生部分抗原决定簇；

– 蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

· 要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

3、抗原修复——方法

· 化学方法

· 加热方法

– 水浴加热法

– 微波照射法

– 高压加热法

– 酸水解法

(1) 化学方法

· 主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。

– 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%～0.1%，消化时间为37C，10～40min，主要用于细胞内抗原的显示；

– 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%～0.4%，消化时间为37C、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。

· 例如：Laminin、CollagenIV

(2) 水浴加热法

· 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。

– 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，

– 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。

(3) 微波照射法

· 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。

· 此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。

(4) 高压加热法暴露抗原

· 将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。

· 由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。

(1) 酸水解法

· 酸水解可使交联断裂、暴露抗原。

· 将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。

· 此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。

加热法的注意事项

· 达到规定的温度(92～95C以上)；

· 维持一定的时间；

· 避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)；

· 加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；

· 修复液：

– 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；

– 最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。

4、载玻片的处理

· 抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。

– 新载玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。

· 常用的粘附剂有：

– APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）

– Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）

– 铬明胶溶液

APES(3-aminopropyltriethoxysilane)

3-氨丙基三乙氧基硅烷

· 现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);

· 将洗净的玻片浸于此液中20～30秒钟；

· 取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60C烤箱烤干。

Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸)

· 将清洁玻片浸于100g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37C放置30min，然后60C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。

铬明胶溶液

· 试剂：铬明矾(chrome alum) 0.25g

明胶(gelatine) 2.5g

蒸馏水 500ml

· 先将铬明矾溶解于40C少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70 C水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。

· 用时稍加溶化，切片浸入2～3min，过夜晾干。 · 冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。

· 在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。

– 缩短了制片时间

– 抗原性不受损失

· 对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。

· 组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。

1、冰冻组织块的常用方法

· 液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196C)中10～20sec；

· 干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至一70C ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；

– 上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。

– 制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 C冰箱。

2、切片

· 供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。

· 载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；

· 切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 C 。切片厚度一般为4～8m。

3、切片后处理

· 切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。

· 冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。 · 贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20C固定10～20min)，再进行免疫染色。

– 盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。

– 为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。 · 大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：

– 血液、尿液、脑脊液；

– 体腔积液；

– 组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织

– 悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。 · 细胞涂片的方法：

– 手涂法

· 将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。

· 图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。

– 涂片机涂片法

· 将细胞样品制成2×105～6/ml 细胞悬液，吸取50～100l (1～2×104～5cells) 加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。

在免疫细胞化学实验中应该根据什么原则选择不同抗体

在免疫细胞化学实验中应该根据什么原则选择不同抗体

人或动物未经明显感染或人工注射抗原而天然存在于体内的各种抗体。又称正常抗体。天然抗体不仅包括针对病原微生物及其产物的抗体，也包括针对非病原性物质的抗体，如血型抗体。除血型抗体主要是受遗传因素的影响外，其余的天然抗体可能是因隐性感染或因受共同抗原刺激而产生的。由于人或动物在出生后总是不断地接触各种抗原，所以有人认为天然抗体的产生与细菌、食物、花粉或异物的刺激有关。因此，“天然”二字的使用并不确切，仅是习惯用法。在一个地区内，天然抗体的平均水平对诊断疾病有一定的参考价值。

免疫抗体，机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。因为最初有人用电泳证明血清中抗体活性在γ球蛋白部分，故曾把抗体统称为两种(γ)球蛋白。后来证明，抗体并不都在γ区；而且位于γ区的球蛋白，也不一定都具有抗体活性。1964年，世界卫生组织举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig)。如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血症、冷球蛋白血症等患者血清中存在的异常免疫球蛋白以及“正常人”天然存在的免疫球蛋白亚单位等。因而免疫球蛋白是结构及化学的概念，而抗体是生物学及功能的概念。可以说，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗体。

为什么在免疫细胞化学技术中要设立对照实验

免疫细胞化学，又称免疫组织化学，其主要原理是用标记的抗体或抗原对细胞相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，经过化学的呈色反应后，用显微镜或电子显微镜观察。该技术是免疫荧光技术与形态学技术结合的产物。