浙江干细胞分离培养（干细胞培养机构）

朋友决定下个月去深圳金时代生物输注干细胞，请问这个公司的脐带血干细胞最新治疗消息细胞来源安全吗?

目前干细胞行业鱼目混杂，主要还是要看干细胞的来源是否正规，干细胞的质量是否过关，干细胞的数量是否货真价实，干细胞的活性度是否达标。干细胞来源是浙江大学医学院生物技术创新产业中心、国家组织工程种子细胞库及金时代生物技术有限公司等联合承担。国家组织工程干细胞库承担着国家组织工程是遵循国家标准的细胞提供机构。与目前的各类干细胞库不同，国家组织工程种子细胞库由科技部“十二五”项目规划，是国内高等级的国家级干细胞库。采用国际一流标准规范管理模式，拥有分布在全球的干细胞及组织工程领域著名专家组成的科学家团队，并采用目前先进的分离、培养、检测、鉴定及保存等设备。 国家组织工程种子细胞库制备的间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞等，在质量、纯度、活性等在国内均处于高水平。目前国内在组织工程、血液病治疗等领域多家知名的医疗机构均由 国家组织工程种子细胞库制备并提供细胞进行临床研究与移植。

脂肪干细胞的材料和方法

1.1 实验仪器与材料

倒置荧光显微镜(IX71, Olympus);数字彩色摄像系统(Sony3CCD);图像分析软件(Image-pro-plus);离心机(Z23, Herm 德国);Transwell (3450-clear, corning, Costar 美国);纯水机(Millipore-Q-Synthesis, Millipore Ltd.法国);六孔板(Corning Incorporated 3516, Costar 美国)。

DMEM 培养基(高糖，GIBCO 公司);胰酶(GIBCO 公司);乙二胺四乙酸钠(上海试剂一厂);胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司);Ⅰ型胶原酶(Sigma 公司);油红O(Sigma 公司);地塞米松(Sigma 公司);胰岛素(Sigma 公司);吲哚美辛(Sigma 公司);异丁基甲基黄嘌呤(Sigma公司)。

实验所采用的脂肪组织均来源于大连沙医生美容医院，并征得患者同意。

1.2 脂肪细胞培养

将吸脂来源的脂肪组织用D-Hanks 冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，把脂肪组织放入离心管中，记录原始体积。向组织中加入等体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30 min。然后将消化好的组织静置5 min，待其分层后，用吸管吸取位于悬液上层的脂肪细胞，将含有脂肪细胞的悬液以1000 r/min(167g)，离心2 min 后弃掉下层悬液得到脂肪细胞。

1.3 脂肪干细胞的分离和培养

参照文献，同上述脂肪细胞的分离一样，将脂肪组织冲净，称重后消化。当消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以1500 r/min(375g)，离心10 min 后弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25 cm2 的细胞培养瓶中。

当干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代，具体的传代方法是：首先，用D-Hanks 冲洗一遍细胞，然后加入2 mL 的混合酶溶液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化，当在显微镜下观察到细胞发生明显的变形，缩成球状后，立即用含有10%胎牛血清的培养基中止消化，并用吸管轻轻吹打瓶底部，确保细胞完全脱落分离到悬液中，再把细胞悬液置于离心机上，以1000 r/min (167g)，离心5 min。最后，将离心得到的细胞团重悬，调整密度为合适密度进行接种。

1.4 脂肪干细胞和脂肪细胞的共培养

将准备好的脂肪干细胞和脂肪细胞分别置于Transwell 的上室和下层中，脂肪干细胞与脂肪细胞的个数之比分别为1:5，1:1，2:1 和5:1(4 组分别命名为A、B、C 和D 组)进行共培养，其中每孔中脂肪细胞的数量均为1×105 个。以上每组均做平行实验(n=3)。

1.5 成脂诱导对照实验

将干细胞以1.5×105 每孔的密度接种在六孔板中，以正常培养基培养的样本为成脂分化实验阴性对照组，以成脂诱导培养基培养的样本为阳性对照组。具体方法是：向基础培养基(DMEM+10%胎牛血清)中加入1 μmol/L 的地塞米松、10 μmol/L 的胰岛素、200 μmol/L 的吲哚美辛和0.5 mmol/L 的异丁基甲基黄嘌呤，配制成脂诱导培养基，每周换2 次液，直到进行成脂染色观察为止，以上对照组均做平行实验(n=3)。

1.6 油红 O 和台盼蓝复合染色

用 0.5%油红O，对成脂诱导后的各组样本进行染色。具体操作方法是：先用D-hanks将样本细胞冲洗充分，然后加入油红稀释染色10~15 min，(油红O 稀释液配制方法:0.5%饱和油红O 原液按3:2(油红O:蒸馏水)加入蒸馏水，然后过滤，待用)，接下来用75%的乙醇溶液将样本分化至间质清晰，然后蒸馏水冲，最后再用台盼蓝对脂质以外的细胞核部分进行复染，并于100 倍镜下观察拍照。以每组样本随机选取5~10 视野进行拍照观察以考察共培养方法的成脂诱导分化效果。

1.7 流式检测

通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为1×105 mL-1，800r/min(120g)，离心5 min，弃掉上清，用4℃的冷D-Hanks 冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800 r/min，离心5 min，之后弃去上清。然后用D-Hanks 将细胞重悬至1 mL，加入抗体5~10 μL，避光，冰上放置30 min。用D-Hanks 冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2~3次，确保将未结合抗体除净最后，加入约200 至300 μL 的D-Hanks 制成悬液，用流式细胞仪检测。

1.8 Hoechst/PI 死活染色

弃掉旧培养基，用D-Hanks 冲洗除去残留培养基然后向每个Transwell 孔中加入质量浓度为1 mg/mL 的Hoechst 33342 大约10 μL，使其终质量浓度为10 μg/mL，37℃下避光反应10 min。待Hoechst 染色完成后，用D-Hanks 冲洗除净残余的Hoechst 染料接下来，再加入用PI 染液，使其终质量浓度为10 μg/mL，4 ℃下避光反应15 min，染色完成也用D-Hanks冲净残余染液最后，将染好的细胞置于倒置荧光显微镜下观察、拍照。

2 结果与讨论

所示的脂肪细胞，与文献中描述的脂肪细胞相一致，图中所示的脂肪干细胞与文献中描述的相一致。均形态完整，生长状态良好，适合进行共培养的后续研究。为成脂诱导阴性对照组，表明脂肪干细胞不能自发生成脂质;图为成脂阳性对照组，在成脂诱导剂作用下，脂肪干细胞能够生成脂质，经统计约有20.3%的脂肪干细胞发生了成脂分化。为共培养后脂肪干细胞染色图片，其中脂肪干细胞与脂肪细胞之比分别为1:5，1:1，2:1 和5:1(其中每孔中的脂肪细胞数均为1×105 个)，尽管在不同比例下对脂肪干细胞和脂肪细胞进行tranwell 间接共培养，然而经过8 天共培养后，脂肪干细胞并不能象成脂阳性对照组那样产生脂质油滴。

此实验结果的原因可能是由于共培养的持续时间过短所致。据文献报导，成脂诱导分化的持续时间通常在1~2 周，即7~4d 左右。因此，有可能由于本实验中脂肪细胞与脂肪干细胞共培养时间过短，导致脂肪干细胞与脂肪细胞没能得到充分作用，所以不能实现成脂诱导分化。

基于上述分析，需延长共培养时间至20d，进一步考察共培养方式中干细胞成脂分化的可行性。

为脂肪细胞与脂肪干细胞经过20d 共培养后脂肪干细胞的Hoechst/PI 死活染色结果。Hoechst 染料对活的细胞具有特异性染色的特点，PI 则对死细胞特异性染色。从中可以看到，两组中的细胞均呈明亮的蓝色，说明细胞的活性很好。基本上看不到PI 染成红色的死细胞的存在。表明，本实验中，经过共培养后的脂肪干细胞，仍拥有良好的活性。

研究可以发现，共培养组a，d，g 3 组均未发生明显的成脂分化现象。通过观察b，e，h 3 幅图发现，经过成脂诱导剂诱导的3 个不同接种密度的阳性对照组中均出现成脂分化，图中可以看到成脂分化后的细胞内出现大量密集在一起的小脂滴，当小脂滴达到一定数量后，就会聚合成为较大脂滴。这些成脂分化的现象与文献中报道的脂肪干细胞成脂分化的过程相一致。通过观察c，f，i 3 组未加任何诱导剂，仅仅使用基础培养基培养的脂肪干细胞的阴性控制对照组，可以看到，脂肪干细胞均匀生长于培养界面上，经过20d 的培养细胞的生长状态良好，未发生明显细胞破碎和衰退死亡的改变。

a，b，c 和d 为各个共培养组的对照组的流式结果图，图e，f，g 和h 为共培养20d 后，脂肪干细胞的表面标记表达流式检测结果。

通过分析可以看到，不同脂肪干细胞与脂肪细胞共培养比例下，共培养组B(共培养比例为1:1)和共培养组C(共培养比例为2:1)的流式结果，与相应的控制对照组B 和组C 相比，CD105 的表达发生下降(b,f,d,h)，CD105 表达分别是，共培养组B 为4.8%，对照组B 为12.4%;共培养组C 为1.3%，对照组C 为6.8%。而另外一个间充质细胞的特异性表面标记CD44，(a,c,e,g)，共培养组B 中为2.9%，对照组B 中为3.1%，没有显着变化;在另一共培养组C 中为0.9%，对照组C 中为5.4%，发生显着变化。

通过以上分析发现(f,g)，经过共培养的脂肪干细胞，其表面抗原CD105的表达发生明显的降低，其结果接近不表达。CD105作为间充质细胞特异表达的表面抗原发生这一改变意味着，脂肪干细胞在共培养过程中可能发生了一定程度上的分化。

3 结 论

采用人体吸脂来源的干细胞与脂肪细胞进行共培养，8d 之内不能促使脂肪干细胞成脂分化。且将共培养时间延长至20d 后，仍未能观察到脂肪干细胞发生明显的成脂分化现象。通过流式细胞仪对共培养的脂肪干细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析，发现共培养后脂肪干细胞与非共培养对照组相比较，其中间充质细胞特异性表达标记CD105 发生明显降低，这就意味着本实验的共培养过程中，脂肪干细胞内部已发生一定程度的改变。

中国七大干细胞库在哪里？

中国七大干细胞库在北京市、天津市、上海市、浙江省、山东省、广东省、四川省。

2020年以前全国设置7家脐带血造血干细胞库，分别是北京市、天津市、上海市、浙江省、山东省、广东省、四川省脐带血造血干细胞库，不再新增。

从20世纪80年代世界上建立第一家脐血库开始，截至目前，全世界已经有40余个国家建立了脐带血造血干细胞存储库，大力发展脐带血库更成为美国、加拿大、日本等诸多发达国家的国家战略。

干细胞优势：

1、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，能够增殖分化并产生大量后代。

2、通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。

3、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。

4、低免疫原性。因细胞处于原始状态，不易被识别，所以不存在免疫排斥的特性，没有血型匹配问题。

干细胞技术的发展

干细胞是什么？萧山区一医院细胞治疗中心主任史军解释：“它就是当我抗衰美容针引起胎停们身体的某个器官组织受损之后能使其自我再生的细胞，简单地说就像壁虎断了尾巴之后能再生一样。”我们经常可以从各种媒体上看见或听到“造血干细胞”这个医学名词，其实用于白血病治疗的“骨髓移植”的主要目的便是“造血干细胞”的移植，而造血干细胞就是能自我更新、有较强分化发育和再生能力、可以产生各种类型血细胞的始祖细胞，它是众多白血病患者起死回生的救星。

干细胞技术，又称为再生医疗技术，是指通过对于干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，并最终通过细胞组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。

干细胞技术是生物技术领域最具有发展前景和后劲的前沿技术，其已成为世界高新技术的新亮点，势将导致一场医学和生物学革命。干细胞技术最显著的作用就是：能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官。由此人们可以用自身或他瞬转细胞免疫荧光实验步骤人的干细胞和干细胞衍生组织、器官替代病变或衰老的组织、器官，并可以广泛涉及用于治疗传统医学方法难以医治的多种顽症，诸如白血病、早老性痴呆、帕金森氏病、糖尿病、中风和脊柱损伤等一系列目前尚不能治愈的疾病。从理论上说，应用干细胞技术能治疗各种疾病，且其较很多传统治疗方法具有无可比拟的优点。

事实上，“干细胞”的概念不仅仅局限于“造血干细胞”，同样，它的用途也不仅仅局限于治疗白血病，“干细胞”研究是在当今医学界十分热门及具有远大发展前景的前沿领域，萧山区一医院细胞治疗中心正是在此领域中迈出了坚实的一步。据悉，区一医院刚刚成立的十五个临床医疗中心之一的“细胞治疗中心”就是在干细胞移植的基础上建立的，该“细胞治疗中心”目前已经和香港科技大学及北京大学研究所建立了合作关系，并聘请了中科院院士、中国血管外科专家汪忠镐教授为顾问。

史军介绍，干细胞除了直接使用之外，将来还可能配合基因修饰，提供原有干细胞不具备的功能，使其成为人造器官组织的来源。目前器官移植来源有限，因此干细胞的潜力备受期待。另外，利用人类干细胞或其衍生的组织、器官测试各种药物的药效、毒理特性，也会比用其他动物更能反映人体状况，可能发展成为一种新的药物筛选模式。干细胞应用于临床治疗，最大的挑战在于稳定的细胞来源、足够的移植细胞量，以及能维持细胞活性的保存技术。目前干细胞的分离、纯化与收集技术，可以说是取得治疗材料的关键，而生物体外细胞工程与选殖、细胞株的增生培养，以及治疗产品的制造，都是此一治疗所需的重要相关技术。

在聊起干细胞研究的时候，史军说道：“很多人形象地把干细胞称为‘干什么都行的细胞’，它存在于人体的各个组织，分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的分化和增殖构成动物发育的基础；而成体干细胞的进一步分化则是成年动物组织和器官修复再生的基础。干细胞技术是指通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，最终通过细胞、组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。”

萧山的血液恶性疾病发生率比较高，除去流动人口200万的基数，这个比例更加大。但是很多病人都选择到杭州的大医院治疗，据统计，在浙江省中医院或是浙一医院的血液科病房就有三分之一的病人是萧山人，其实这些病人中的相当一部分完全可以在萧山本地得到效果相同但却更廉价的治疗。

在区一医院血液科曾经有一例在十年前被确诊为M3型白血病的患者，医院给其应用了当时十分先进抗癌药物“全反式维甲酸（RA）”并进行了长期的化疗，此患者至今仍和正常人一样地生活着。另外还有一例患急性淋巴细胞白血病的患者和一例多发性骨髓瘤的患者在区一医院血液科的治疗下至今也分别存活了五年和三年。

为了更好造福萧山老百姓，为血液恶性疾病缠身的病患解除痛苦最终带来生还的希望，这个刚成立的“细胞治疗中心”正计划利用血细胞分离机进行外周血干细胞采集及干细胞输注治疗实体瘤和各类疾病（如脉管炎、糖尿病足），并积极为进一步开展骨髓移植作好准备工作，同时开展实体肿瘤的内科治疗（化疗）。

“整体来看，干细胞治疗现在仍受限于安全性及其治疗效果，还没有普遍应用。若要利用干细胞进行研究与产品开发，仍需要熟悉细胞培养，了解细胞分化机制，这有赖广泛的科学研究来提供相关理论。目前，越来越多的研究确认，多能成体干细胞具有高度应用价值。将来也许能避开胚胎干细胞研究引起的伦理争论，并应用于细胞疗法、组织工程以及再生医学，带动干细胞产业的发展。可以预见的是，在不久的将来那些传统医学方法难以医治的多种顽症，诸如白血病、早老性痴呆、肝硬化、糖尿病等都将通过干细胞技术获得治愈的希望。21世纪是生命科学的时代，也是为人类的健康长寿创造世界奇迹的时代，干细胞的应用将有广阔前景，让我们拭目以待。”史军充满期望告诉记者。