小鼠胚胎干细胞培养环境（小鼠胚胎干细胞培养基）

求助小鼠胚胎的老年人脱发的原因培养

取得胚胎的时间点不同，胚胎发育的情况也不一样。我也做过从一细胞开始培养，但大多数胚胎不发育或在发育的途中停止，囊胚率很低。越接近囊胚时期取胚，囊胚的发育率越高。看你太保车险电话的情况，四、八细胞胚胎培养能得到囊胚，培养系统应该还是干细胞美容前后效果图正常的。从我的经验看，小鼠胚胎从二细胞发育到四细胞是一个关键点，从桑甚胚发育到囊胚又是一个关键点。我建议你检查一下你的培养液，可以适当加大血清的浓度。也可以在胚胎发育到四细胞后将一半的培养液吸出，在补充新的培养液。

PS：不同培养液的效果可能不同，实在不行，换其它的培养液也未尝不可。

以色列研究人员打破传统生殖方式成功合成小鼠胚胎，这项技术的难点在哪？

以色列研究人员打破传统生殖方式，成功合成小鼠佩戴这项技术的难点主要在于不使用精子卵子和子宫的情况之下，将小鼠的胚胎合成。

近日大家看到这样的一个消息，以色列的研究人员在打破传统的生殖方式，将小鼠的佩戴成功合成，在这个状况之下是不需要使用卵子和精子也不需要使用子宫，就能够将小手的胚胎成功合成之后，就将小手的佩戴直接放进人造的子宫中培养，观察的时间有8天，所以这样的技术对于干细胞科学来说又是一项进步，并且打开了一扇窗户，可以发现，人类一直在创造很可能在某一天会有一些器官能够拯救人类，更能拯救数以万计的鲜活生命。

在8月初的时候，大家就看到这样的一篇研究文章，是从一个科研团队中了解的，小鼠的胚胎干细胞能够制造出小鼠胚胎，这是一种新型的生物反应器，并用这种反应器对小鼠胚胎进行培养，开始的时候胚胎发育就有心脏这样的器官，出行在实验的过程中研究人员直接将小鼠的胚胎干细胞以及基因进行改造，在细胞中培养了5天，最后转移到旋转的培养容器当中。

在培养这些细胞的第8天，细胞已经有了胚胎状的组织，而且非常的自然拥有心脏跳动正常，还能够清晰的看到头尾末端里面还有骨骼的块状体积以及大脑和其他的器官出行。通过研究与人员的测量会发现里面有4万多个胚胎细胞基因活性非常的强，而且这也是非常重要的一个里程碑，有了不一样的探索和发现。这项技术可以用来替代升职也能够培养出一些器官更是干细胞疗法的，关键支出能够修复人体的自身组织，这更是一个艰难的挑战，也是一个惊奇的发现。

胚胎干细胞培养是如何培养的？它的具体操作过程？饲养层细胞是成纤维细胞，那它的详细作用是什麽？

【推荐】胚胎干细胞培养标准化操作规程胚胎干细胞培养标准化操作规程 6/28/01

目录

一、细胞

二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态

培养基

细胞复苏

冻存细胞

明胶包被

细胞传代

三、体外分化

培养基

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

体外分化方法

四、移植细胞的准备

细胞

多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡

1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。

2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。

3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。

一般培养--维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基

ES:

配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液

DMEM(高糖)

马血清（HS）

L-谷氨酰胺（200mM）

MEM NEAA（10mM）

HEPES（1M）

β-巯基乙醇（55Mm）

PEST

ESGRO

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：

1．从液氮中取出一管细胞；

2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；

4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

5．离心3分钟；

6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

8．孵育。

冻存细胞

冻存液

90％HS和10％二甲基亚砜

步骤：

1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；

2．用细胞刮刀收集细胞；

3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；

4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）

5．分装于冻存管内，每管1ml；

6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

明胶包被

准备500ml 0.1％明胶溶液

1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。

2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。

包被培养板或培养皿

1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；

2．置室温30分钟；

3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。

细胞传代

建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。

1．去除培养液；

2．1×无钙镁PBS洗涤；

3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。

4．加入ES培养基使胰酶失活；

5．将细胞转入15ml离心管中离心3min；

6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。

如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。

7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；

8．将含有细胞的培养基转入明胶包被（见下文）的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）

9．建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC)

保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。

体外分化

多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。

时间线（总时间为27～34天）

第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天

培养基

EB

配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液

DMEM(高糖)

胎牛血清

L-谷氨酰胺（200mM）

MEM NEAA（10mM）

HEPES（1M）

β-巯基乙醇（55Mm）

PEST（P104U/mlS104μg/ml

ITSFn and N3：

配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml FALCON管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。

贮存液

DMEM(高糖)

转铁蛋白50mg/ml

胰岛素5mg/ml

亚硒酸钠300μM

黄体酮（20μM）

腐胺（100μM）

PEST（P104U/ml S104μg/ml）

层粘连蛋白100μg/ml

纤维连接蛋白250μg/ml

碱性rhFGF, 10μg/ml

*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。

ITSFn and N3培养基贮存液的准备

使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。

贮存液 溶剂，贮存液，稀释剂和储存

转铁蛋白50mg/ml

胰岛素5mg/ml

亚硒酸钠300μM

黄体酮（20μM）

腐胺（100μM）

PEST（P104U/ml S104μg/ml）

层粘连蛋白（100μg/ml）

纤维连接蛋白（250μg/ml ）

碱性rhFGF, （10μg/ml）

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

包被液的准备

多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml

把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。

纤维结合蛋白，1μg/ml

把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被过程：

1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时（过夜也行）

2．吸出多聚-L-鸟氨酸

3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时

4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干

5．贮存在4℃

24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。

体外分化方法

第1步：ES培养基

在LIF（ESGRO）存在的条件下维持细胞培养

第2步：EB培养基

使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。

1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）

2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。

3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液

4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。

5．2天后更换培养基

将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。

6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。

形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。

第3步--ITSFn培养基

在最少量培养基中选择神经前体细胞

1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基

2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。

3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。

观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。

第4步－N3培养基＋bFGF

通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。

1.PBS洗涤，加入2ml 1×胰酶（1个15cm的培养皿所需胰酶的量根据前文表中的体积）（10×胰酶EDTA用PBS稀释）

2．37℃孵育5分钟

3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。

4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。

5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。

6．2天后更换培养基

第5步－N3培养基

通过撤除bFGF使神经前体细胞分化

1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基

2．根据需要换液（大约每隔一天）

3．分化10～15天后固定细胞

移除培养基

PBS洗涤

加入4%福尔马林

室温放置30分钟

PBS洗涤2次

储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS

移植细胞的准备

细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。

移植

1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。

细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。

2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中

3．离心3分钟

4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）

5．37℃水浴5分钟

6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次

小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。

7．离心2分钟

8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基

9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次

10．离心2次

11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基

烟酸己可碱标记ES细胞进行移植

1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）

2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）

3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）

4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，

5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟

6．离心2分钟

7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基

8．重复一次

9．离心2分钟

10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。 这是我最近翻译的一篇有关胚胎干细胞的文章，译的不好，但是意思应该还算准确。不好意思，有两个表格没有发上，哪位老师告诉我该如何编辑表格。谢谢了！ 谢谢，顶！ 我也顶 很好的帖子哦!我查了好久终于找到了.万分感谢! 谢谢，现在还没用到，就当先了解一下好了。再次谢谢！ 谢谢非常感谢 有原文吗？

如果有可以发到我邮箱（j3104@163.com）吗？谢谢！！ 好贴！

能将英文原文贴上吗？或者发到我的信箱：adjfchen@hotmail.com

谢谢！ 不错不错，我这里发一些关于干细胞的相关知识

干细胞的概念

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。

在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成年组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力。而成年组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。

然而，这个观点目前受到了挑战。

最新的研究表明，组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。

干细胞具有自我更新能力（Self-renewing），能够产生高度分化的功能细胞。干细胞按照生存阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞 。

1.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞（Embryonic Stem cell， ES细胞）

当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。早在1970年Martin Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养。而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。

进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。

目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。在98年末，两个研究小组成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。然而，人类ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类ES细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，因此要求展开人类ES细胞研究的呼声也一浪高似一浪。

1.2 成体干细胞

成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。最近研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞,说明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。

1.3 造血干细

造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。今年年初，协和医大血液学研究所的庞文新又在肌肉组织中发现了具有造血潜能的干细胞。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。

获得胚胎干细胞的方法

小鼠ES细胞

小鼠ES细胞的分离方法基本成熟，且已广泛应用于生命科学研究的各个领域。1981年Evans首次分离得到小鼠ES细胞，他以手术切除受精后2.5 d小鼠卵巢并结合激素注射干扰子宫环境，从而使胚胎延迟着床，再回收胚胎，将其体外培养于STO细胞饲养层上，结果得到了小鼠ES细胞系。Martin G R以免疫外科法剥离小鼠囊胚滋养层细胞，得到内细胞团(ICM)并将其置于STO细胞饲养层上，培养基为小鼠PSA-1 ES细胞条件培养基，结果也得到小鼠ES细胞。此后，Axelord等用微滴法得到小鼠ES细胞系；Kaufman等用单倍体延迟着床小鼠囊胚建立同源二倍体ES细胞系；Wobus等首次用原代小鼠成纤维细胞作饲养层建立了小鼠ES细胞系；Smith等首次使用大鼠肝细胞条件培养基作为分化抑制物建立了小鼠ES细胞系。Brook F A等进一步完善了小鼠ES细胞的分离方法，以致从许多品系小鼠包括近交系和突变系，都可获得ES细胞。 体细胞核移植

分离小鼠ES细胞并非只能从囊胚，也并非必须依赖饲养层细胞。Dhhaise等将52枚8-细胞小鼠胚胎消化成单个分裂球并培养于小鼠原代成纤维细胞饲养层上，所用培养基为DMEM/F12，并添加100 mL/L的胎牛血清、100 mL/L的新生犊牛血清和0.1 mmol/L的2-巯基乙醇，5天后，出现多个干细胞集落，消化传代后建立了一个ES细胞系MSB1。将MSB1注入SCID(severe combined immunodeficient mice)小鼠，能产生包含三胚层分化物的畸胎瘤，注入52枚囊胚产生了2个活的个体(1雄，1雌)，但雄性个体无生殖能力。Tojo等用同样方法从杂交小鼠(C57BL/6×DBA/2)8-细胞胚也得到了ES细胞。小鼠ES细胞具有无限增殖的自我更新能力。Suda Y等将小鼠ES细胞传250代以上没有出现转化的迹象，它们仍具有正常的二倍体核型；在生殖系嵌合体中能产生正常的配子；作为核供体能重组克隆胚胎。上述结果表明小鼠ES细胞是永生性的。

大鼠ES细胞

Iannaccone P M等从大鼠PVG近交系分离克隆大鼠ES细胞系-RESC-01，该细胞系对SSEA-1和AKP呈阳性，在大鼠胎儿成纤维细胞饲养层上能很好的增殖，在体内环境能分化形成多种细胞类型。RESC-01细胞系在体外悬浮培养时形成的胚体出现有节律的收缩运动，将其注入囊胚并移植假孕母鼠能生成嵌合体。Kawase等也利用大鼠胎儿成纤维细胞做饲养层，从DA大鼠品系分离建立了RES-DA1ES细胞系，它与小鼠ES细胞形态相似，表达AKP和4C9抗原。Brenin等也用不同的方法分离得到了ES细胞。Sun等以大鼠ES细胞为核供体，得到了核移植后代。Vassilieva等发现大鼠ES细胞表达SSEA-1、Oct-4和IL-6等细胞标记。

猪ES细胞

Piedrahita J A等采用STO、猪成纤维细胞和猪子宫上皮细胞作为饲养层，以DMEM为基础培养液，从猪囊胚ICM分离ES细胞，发现猪囊胚ICM在STO或PMEF饲养层上可以附着增殖，而在猪胎儿成纤维细胞饲养层上虽可附着但增殖甚微，传不过4代即发生死亡。Evans等将6天～7天猪囊胚直接培养于STO饲养层上，挑出ICM细胞经增殖传代培养建立了猪ES细胞系。Strojek R M等认为分离猪ES细胞的最适胚胎为第10天囊胚。研究表明，6日龄～7日龄胚胎在培养过程中极易发生死亡，IC

胚胎干细胞研究(16张)M克隆获得率极低，而第10天的胚胎容易培养，ICM克隆获得率较高，但细胞易于分化。Vasil’ev I M等研究了胚胎发育阶段、培养基种类、饲养层细胞等影响猪ES细胞分离的因素，结果表明不同发育阶段的附植前囊胚是影响猪ES细胞分离的限制性因素。Wheeler M B等报道猪ES细胞能形成正常的嵌合体和包含三胚层分化物的囊状胚体，在维甲酸和DMSO的作用下，猪ES细胞能分化形成上皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等，Miyoshi等从体外授精囊胚分离得到猪ES细胞，并以类ES细胞为核供体，获得了核移植囊胚。国内关于猪ES细胞分离克隆的研究相对较少，李松等分离得到猪ES细胞并传至第2代，在此基础上，徐军等将猪ES细胞传至3代，冯秀亮等将猪ES细胞传至5代，冯书堂等也分离得到猪ES细胞，同时对所分离的细胞进行了初步检测和鉴定，证明其具有多能性。

牛ES细胞

Saito等在加有LIF的培养基中对牛ICM进行培养，分离得到牛ES细胞并进行传代。Sims等使用与一般ES细胞分离完全不同的低密度培养法，使用BRL(buffalo rat liver)条件培养基并添加亚硒酸钠、胰岛素、运铁蛋白和50 mL/L胎牛血清，培养6 d～10 d，得到15个ES细胞系，将其作为核供体进行核移植得到659枚重构胚，卵裂率70%，囊胚率24%，将其中34枚胚胎移植27头假孕母体，13头妊娠，最后生出4头犊牛。而Stice S L等报道，以牛ES细胞为核供体建立的重组胚在移植受体后虽然会出现妊娠现象，但妊娠时间不超过60天，主要是因为胎盘畸形发育，包括缺乏子叶以及子宫阜出血反应。若将重组胚与正常8-细胞胚嵌合，则该嵌合胚可发育至85天，胎儿同样缺乏子叶，DNA分析证实50%的嵌合体胎儿组织来源于ES细胞。Ito等分析比较了牛体内和体外培养的桑椹胚分裂球和囊胚ICM分离ES细胞的效果，结果仅在囊胚组获得了类ES细胞。Cibelli等由49枚7日龄牛胚胎ICM分离到27个ES细胞系，用注射法将β-半乳糖苷酶基因导入ES细胞，选择转染的ES细胞注入8-细胞～16-细胞牛胚，其中18枚胚胎移植7头受体，妊娠5周后，得到12个胎儿。对胎儿进行检测，6个胎儿分别在生殖腺或原始生殖细胞(PGCs)中检测到标记基因，表明ES细胞参与生殖系嵌合。Cibelli等建立应用牛胎儿成纤维细胞核移植生产转基因牛类ES细胞的方法，得到6头嵌合体。Mitalipova等自致密桑椹胚分离牛ES细胞，最高一株ES细胞传至150代，且表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4和c-kit受体。

羊ES细胞

Handyside等以绵羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞作饲养层，从7日龄～8日龄绵羊囊胚分离类ES细胞，结果得到内胚层样细胞而无ES细胞出现。Tsuchiya用免疫外科法分离8 d～9 d绵羊囊胚ICM，培养于STO细胞饲养层上，得到2个类ES细胞系，传至4代。Tillmann等用胎牛肝成纤维细胞作饲养层分离得到传至20代的绵羊类ES细胞和40代的山羊类ES细胞。Modinski等将绵羊ES细胞与囊胚嵌合得到2只嵌合体绵羊。Campbell等用第1代～第3代的类ES细胞作核供体进行核移植，得到了4只绵羊。

兔ES细胞

Graves K H等从兔子附植前囊胚分离得到ES细胞，并进行了初步鉴定，证明它们具有在饲养层上保持未分化状态的增殖能力，体外传代培养1年以上，仍具有正常的核型，且能形成包含三胚层分化物的胚体。之后，Niemann等以PMEF为饲养层，建立了9个兔ES细胞系。Schoonjans L等将兔ES细胞注入囊胚获得了包括生殖系在内的嵌合体兔子。陈颖等以PMEF为饲养层培养兔分割囊胚，结果得到传至7代的兔ES细胞，将第2代的兔ES细胞与囊胚进行嵌合，得到1只皮毛嵌合体仔兔，但未证实ES细胞是否参与了生殖系嵌合。

以色列在不使用精子、卵子的情况下合成小鼠胚胎，这个技术有哪些应用价值？

以色列在不使用精子卵子的情况下，合成小鼠胚胎这种技术的应用价值可以用于肝脏移植

胚胎干细胞培养

实验室用的胚胎干细胞系，是从做试管婴儿等治疗剩下的早期胚胎（囊胚内细胞团）中分离建系得到的稳定传代的体外培养细胞系。

已经分离得到的胚胎干细胞系，是不具备自然发育为胚胎的能力的，不会再移植回人体。

目前在体外可以做到体外受精，并且发育到早期胚胎阶段，像你说的体外把早期胚胎发育为个体的技术叫做人造子宫，目前技术还是无法做到的，只在科幻电影有。