免疫细胞分类及分离的方法（免疫细胞的分离与功能检测）

免疫细胞的主要种类及各自的分离方法

T啊B啊DC啊NK啊 很多种，每种都有好多更细的分类，一般用流式细胞仪加CD分子标记分选

简述主要免疫细胞分离方法和分离原理？

免疫磁珠法分离细胞原理：

免疫磁珠法分离细胞是多能干细胞有哪些基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。

免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：

阳性分离法－磁珠结合的细胞就是珠海公积金怎么提取所要分离获得的细胞

阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞

一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。

BD™ Imag 磁珠：

· 大小在0.1－0.45mm

· 包被了BD Pharmingen生产的高质量单抗

· 磁珠已为白细胞亚群的阳性和阴性分离法所优化

· 用于BD™ IMagnet direct magnet

将包被了特异性单抗的BD IMag磁珠加入细胞悬液，磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合，通过BD™ IMagnet direct magnet分离得到的连有BD IMag磁珠的细胞可直接用于功能试验和用流式细胞仪检测。

缺点：

• 对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养

• 纯度低

• 容易阻塞FCM的喷嘴

BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分离系统的优点，开发出直径约200nm中等大小磁珠。

• 技术简单，分离在普通的试管中完成

• 易于增大细胞用量

• 对细胞温和，不影响细胞功能及其分离后培养，可直接上流式

• 纯度高，回收率高

• 成本低

此外，Mouse lineage panel中biotin标记的抗体还可用于FCM分析细胞表面抗原，以及进行细胞/组织免疫荧光实验。

BD提供2种免疫磁珠：

· 包被了针对白细胞亚群的单抗的磁珠

· 包被了链霉亲和素（streptavidin）的磁珠：此种情况下，在实验系统中加入生物素标记的单抗，磁珠通过streptavidin与生物素标记的单抗结合，单抗与细胞表面相应抗原特异性结合而使细胞被磁珠间接捕获，从而达到分离。这种磁珠使研究者可根据自己需要选择生物素标记的各种单抗去分离目的细胞，应用范围更广泛，使用更灵活。

不同物种磁珠分离试剂

人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；

小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.

ë 利用Streptavidin连接的磁珠，只需选配biotin标记的所需单抗,就能分离更多种类细胞

新货聚焦：

现在，BD PMG又推出用于分离小鼠造血干细胞/祖细胞的新试剂mouse lineage panel。

其中包括5种biotin标记单抗，这些单抗能结合小鼠造血细胞的主要分化系细胞: T、B淋巴细胞，单核/巨噬细胞，粒细胞和红细胞。将这组试剂与Streptavidin Plus BD™ IMag Particles (557812) 联合使用，就能通过免疫磁性分离法去除小鼠骨髓造血细胞的主要分化系细胞，从而富集到造血干细胞和祖细胞（阴性片断）。

Mouse Lineage Panel（559971）：（5×2ml/vial） 可分离109 Mouse骨髓细胞

1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain)；

2) Biotin-anti-mouse CD11b；

3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220；

4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1)；

5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76)

磁分离细胞的重要指标是面部皮肤护理小常识：

纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。

目前市场上有2种磁性细胞分离系统：

* Small particles (≈50 nm) － MACS

* Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）

小磁珠 优点：

• 对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养

• 可直接上流式检测，不影响散射光

缺点：

• 需要很强的磁场来分离细胞

• 分离速度很慢，得率不高

• 需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行

• 成本昂贵

大磁珠

• 技术简单，分离可在试管中完成

• 易于增减细胞用量

• 速度快，得率高

• 成本低

免疫细胞分类及分离方法是什么？

免疫细胞（immunecell）主要是指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛泛，主要是T、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单该吞噬细胞系统的细胞。免疫细胞分离技术\x0d\x0a1、淋巴细胞的分离\x0d\x0a取肝素抗凝血1m1加Hanks液1m1稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min水平离心20min，管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次2000r／min离心10min，最后用RPMIl640培养液将细胞配成2×106／m1的细胞悬液备用。\x0d\x0a2、T细胞及B细胞的分离\x0d\x0a将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMIl640培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B细胞，并用少量的RPMIl640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。\x0d\x0a\x0d\x0a3、CD4细胞及CD8细胞的分离\x0d\x0a（1）CD4细胞的分离：将一定量的T细胞悬液通过一根SephDdexC—10柱，然后用少量的RPMll640培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4细胞。\x0d\x0a（2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置2小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1PBS吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMIl640培基中备用。CD4细胞亦可用此法分离。\x0d\x0a4、单核巨噬细胞的分离\x0d\x0a单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃C02温箱内温育1小时，然后用RPMI1640培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。