大鼠骨髓间充质干细胞培养的实验报告（小鼠骨髓细胞培养）

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如何设计sd大鼠的骨髓间充质干细胞pcr引物前体

所谓骨髓移植，是从捐髓者的骨骼(通常是盘骨)抽取健康的骨髓细胞，过程约需半小时，然后以输血形式注入病人体内；病人亦可与医生商量，选择于手部抽取血液，透过分离机收集当中的血干细胞，但过程较从盘骨抽取骨髓细胞长，至少需时三小时。

抽取骨髓造血干细胞有两种方法：一是医生在供者的髂骨部位穿刺采集骨髓中的造血干细胞，术后一两天内有些疼痛，一周内就可完全恢复。二是用科学的方法有效地动员骨髓和其他部位的造血干细胞大量释放到外周血液中去，从供者的手臂静脉中采集，并通过机器将造血干细胞分离出来，剩余的血液回输到供者体内。

如何保存大鼠腿骨组织，取骨过程是否要求绝对严格无菌？准备提取骨髓间充质干细胞进行原代培养。

没那么严格要求的 我中国医学科学院上海细胞库们这边有做组织工程的实验室 早上去菜市场还是屠宰场的 买了外泌体再生抗衰是什么骨头 然后拿回去取细胞培养都没问题的

大鼠骨髓间充质干细胞用什么转染

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记

建议楼主查询文献啊

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类非常 重要的成体间充质干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，具有支持和调控造血的作用，能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞类型。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养技术

  一、实验前准备 

实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。

1. 选取 SPF 级，体重 100~150g 左右的SD 大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为 75%的乙醇中浸泡 5 min。

2. 工作台紫外消毒后，采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。

3. 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

 二、全骨髓提取  

1. 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。

2. 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。

3. 用无菌PBS 浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于 10ml 含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM 完全培养液的无菌培养皿中，取出 1mL 注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓， 重复 3 次，再反方向冲出骨髓，重复 3 次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。

  三、细胞制备

吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于 15 mL 离心管中，1000 r/min 室温离心5 min。

 四、接种培养  

1. 离心后去上清，用 6mL 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至 25 cm

2. 培养瓶中，轻轻摇匀;置于 37 ℃、体积分数为 5%的 CO2饱和湿度培养箱中培养。

3. 24 小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。换液，去除漂浮的血细胞， 以后每两三天换液 1 次，直到增殖达到融合。4. 约 7 天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达 80%~90%，可进行细胞传代。

  五、细胞传代

待细胞融合至 80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的 PBS 轻轻冲洗后，吸去 PBS。采用消化液消化 1-2 分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA 浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。

本实验以 1：2 进行传代。

  六、细胞观察 　

细胞传代到第 3 代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达 95%以上。此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34 阴性，CD44 阳性。

从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。

  七、注意事项   

1. 缓慢冲洗骨髓腔：

冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。

2. 严格无菌：

取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作

3. 培养基中血清浓度：

过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。而且一般来说，选择质量好 10%的胎牛血清有利于 MSCs 的培养

4. 原代细胞静置培养：

原代细胞置于培养箱 24～48h 内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁。

归肾丸水提物干预SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖及PI3K、AKT蛋白的表达

摘要：

归肾丸： 归肾丸原方出自《景岳全书》，全方由熟地、杜仲、山药、枸杞子、菟丝子、茯苓、当归、酒萸肉8味药组成，有补肾填精、调理冲任的功效，常用于治疗妇科疾病。作者采用纯水煎煮的方法获取归肾丸，所制得的归肾丸冻干粉1 g含生药量约为5.2 g。

原代骨髓间充质干细胞： 原代细胞是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，传代前保持原有细胞的基本性质，通常把第1代至第10代以内的细胞统称为原代细胞。该实验从3周龄雄性SD大鼠的双侧股骨骨髓获取原代骨髓间充质干细胞，经200目筛网过滤后，用全骨髓贴壁法纯化，经鉴定后选取纯度和增殖能力均较高的第3代细胞进行后续实验。

背景： 补肾类方剂对骨髓间充质干细胞的促增殖作用已经被证实，但其作用机制尚不明确，该研究以归肾丸为例，探讨其可能的作用机制。

目的： 通过观察归肾丸水提物对骨髓间充质干细胞增殖的影响，探究归肾丸滋补肾精与骨髓间充质干细胞增殖之间的关系。

方法： 从3周龄雄性SD大鼠股骨骨髓中分离提取骨髓间充质干细胞，采用全骨髓贴壁法将其纯化，选用纯度较高的第3代细胞进行药物干预，将其分为空白对照组和10，20，40，80，100 mg/L归肾丸水提物组，在体外连续培养5 d以观察量效关系和时效关系。倒置显微镜下观察细胞形态，CCK-8法评估细胞增殖活性，Western blot检测细胞中PI3K、AKT蛋白表达。

结果与结论： ①归肾丸水提物组的细胞增殖能力明显高于空白对照组，存在一定的量效和时效关系，尤以 80 mg/L归肾丸水提物干预3 d时作用效果最佳；②归肾丸水提物组骨髓间充质干细胞中PI3K、AKT蛋白的表达明显高于空白对照组；③结果提示，归肾丸水提物能有效促进骨髓间充质干细胞的增殖，可能与其参与调控PI3K/AKT信号通路有关。

ORCID: 0000-0003-0720-4797(刘燕)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 归肾丸, 细胞增殖, PI3K, AKT, 滋补肾精

文章来源: 刘 燕, 关永格, 宋 阳. 归肾丸水提物干预SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖及PI3K、AKT蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(13): 1983-1988.

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