间充质干细胞外泌体在制备促进皮肤组织修复（间充质干细胞外泌体提取）

什么是干细胞技术发展方向细胞外泌体？

外泌体之前是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。当外泌体在1980年首次发现后，曾被认为是细胞排泄废物的一种方式，如今发现外泌体具有多种多样的功能。

外泌体组成成分：外泌体成分是高度异质性的，能反映出产生它们的细胞表型状态，所以外分泌体发展成为了液体活检的重要分支。肿瘤病人外泌体异质性会升高。

外分泌体成分：由脂质双层组成，包含细胞的所有已知的分子成分，包括蛋白质、RNA和DNA。

外泌体功能：准确的说，外泌体功能未知。

外泌体可携带蛋白质药物及核酸等，治疗潜力巨大：

1、心血管疾病：使用外泌体携带修复分子损伤的心肌，可进行特异性修复。

2、神经退行性病变：使用神经或大脑特异性的靶分子，将携带药物的外泌体，送至神经系统，治疗大脑区域的疾病或者肿瘤；

3、皮肤损伤：将有助于伤口愈合的分子，通过外泌带到伤口局部，进行治疗。外泌体还可以携带抗炎分子到达炎症局部，进行抗炎治疗等。

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我7d抗衰仪器价格们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他面部护理小常识各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。

为什么年龄越大的人，伤口愈合越缓慢？

伤口愈合指由于致伤因子作用造成组织损伤后，局部组织通过再生、修复、重建，进行修补的一系列病理生理过程。

众所周知，年老身体伤口愈合需要更长的修复时间。自从一战以来，这种现象就已被记录下来——年老士兵体内，伤口愈合得更慢。

其实年龄大的人伤口愈合，与人体一系列由年龄带来的生理变化有密切的关系！

01 与免疫细胞的缺席有关

年龄越大，伤口愈合越慢。这和老年人的全身综合因素有关。一些高龄患者细胞再生能力比较差，一般组织再生能力也会减退，从而导致伤口愈合的延迟。

研究发现，免疫细胞对于伤口愈合必不可少。巨噬细胞在小鼠受损组织中的血管周围蓄积，而且在心肌梗塞或周围缺血后也会在人体内积聚，可以看到这些巨噬细胞调节血流，执行必要的损害控制功能。该研究证明更多的巨噬细胞聚集在血管周围，从而提高了其调节血流的能力。反过来，这导致了伤口愈合的改善，并且小鼠能够更大程度地使用受伤的腿。

2016年11月17日 ，《Cell》杂志上发表了洛克菲勒大学通过检查衰老小鼠皮肤上分子变化的试验，并描绘了身体愈合伤口的过程。

洛克菲勒大学细胞生物学教授、霍华德·休斯医学研究所研究员Elaine Fuchs表示，数天以内的受伤，皮肤细胞迁移并关闭伤口，这一过程需要协调附近的免疫细胞。

他们的实验表明，随着年龄增长，皮肤细胞和免疫细胞之间的通信逐渐中断。而伤口愈合需要存在于皮肤的特异性免疫细胞。受伤后，伤口边缘的角质细胞通过产生一种叫做“Skint”的蛋白，唤醒附近的免疫细胞（包括树突状上皮性T细胞，DETCs）来填补缺口。这一发现或可开发出加速治疗老年人的新方法。

02 与干细胞再生能力衰退有关

人的年龄越小，细胞的生长速度也就越快，伤口愈合也就快！随着年龄增长，人体内干细胞的再生修复能力下降，导致伤口延迟愈合。

大多数情况下，现有治疗方法能实现伤口愈合的百分比仅为50%～60%。因此，一直以来，促进机体伤口愈合的新方法都是科学家们不断研究的重点领域。

在一项刊登于国际杂志《Stem Cells》上的研究报告中，来自洛杉矶再生医学研究所的研究人员提出证据阐明了干细胞在眼角膜伤口愈合过程中所扮演的关键角色，同时还揭示了干细胞移植如何用来精细地调节伤口的愈合过程，并且为患者带来一定健康益处。

《Stem Cell Research Therapy》也曾发表一项相关研究成果，科学家发现脐带间充质干细胞分泌的外泌体有促进伤口愈合的功效。

多项研究证实，在全身或创面局部应用间充质干细胞治疗，均可促进损伤皮肤的修复并提高愈合质量。间充质干细胞治疗可以促进创面愈合过程中血管的生成，缩短患者的康复时间。不仅如此，间充质干细胞对慢性难愈性伤口或迁延不愈的伤口也有很好的疗效。

03 营养也是不可或缺的因素

营养与伤口愈合紧密相关。

维生素、矿物质、不同类型的蛋白质和必需脂肪酸都属于营养，它们具有维持机体正常生长、发育、生殖以及健康的作用。因此在人体营养供应不足时，身体生长发育缓慢，伤口愈合的速度也就越慢。

营养对伤口愈合的影响在许多医疗过程中得到重视。例如，伤口愈合缓慢的老年人在健康状况允许的情况下可以通过改变饮食，增加蛋白质摄入量促进康复。与维生素A一样，维生素C也对伤口愈合有一定影响，因为它对形成胶原蛋白很重要，这是帮助绑定组织细胞的蛋白质，也是保持牙齿，骨骼，皮肤和筋腱必需的。此外，它还帮助抵御感染，因此在营养和伤口愈合之间有间接联系。

04小结

伤口愈合是一个涉及多种细胞类型和生物活性因子的多因素复杂过程，伤口的大小、位置和炎症反应都可能影响伤口愈合进程。一旦出现伤口，一定要及时正确处理，避免伤口感染。

其次，日常饮食要均衡，多吃新鲜果蔬，富含维生素A和C的食物能加速伤口愈合，合理补充蛋白质及胶原蛋白，避免进食发物及辛辣刺激性食物。

此外，还需要注意患者的心理状态，如长期的压抑、紧张、焦虑等社会因素，也可以通过神经内分泌系统导致机体的免疫功能受损，从而间接地影响伤口愈合。