流式细胞术鉴定干细胞原理（流式细胞术细胞检测原理）

流式细胞术的作用原理

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是外泌体研究现状一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点。

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷流式细胞术酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

细胞的分选是免疫治疗一次的大概费用通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

流式细胞术原理

流式细胞术公开课

会形成鞘液流（鞘液是干细胞美容的商业模式为了保证细胞在中间形成单个排列的细胞流，因为要保证激光覆盖整个样本中心流）在外周，样本流在中央的层流状态，使得样本仅在轴心

激光照射到样本流上，激光60um宽，20um高（宽高有限，只有样本流刚好在中间才能保证激光能覆盖样本流细胞）

样本流中的细胞表面的荧光抗体受到激光的照射以后，会被激发出荧光；

有两个镜头接受荧光信号，

一个是forward scatter-FSC检测器（前向散射光），另一个是side scatter-SSC侧向轴检测器/荧光信号检测器（与激光90度）

收集到的光信号就被光纤传导到光分离系统中去了，

光信号手机系统的内圈是长通滤片

中圈和外圈分别是带通滤片和PMT（啥？）

刚才细胞经过激光照射会有四个重叠的光谱，x轴是波长，y轴是强度

第一步，通过长通滤片，光信号被切割

第二步，经过带通滤片把特定波长的波过滤过来，不符合波长条件的波被反射

第三步，经过过滤的波，经过PMT转变成电信号，

PMT元件是电信号检测分析系统，

左边是光电转换膜，上下两边有不同的小电极，

侧边有电子检测器，

光信号转换成电信号的过程：

光子打到左边的光电转换膜上---- 膜上就会蹦出一个电子，这样就初步实现了光信号转变成电信号 ---- 电信号经过不同的电极就会反弹 ---- 电子经过反弹，电信号实现级联放大作用(通过调整电压可以调整最终的电信号大小) ----- 检测器上就会形成一个电脉冲

表示电脉冲有三个参数：

峰宽+高度+峰下面积A；

常规的一般用峰下面积A来表示

下面是经过电信号转换的信号强度值，反映了每个荧光信号的强度；

每一行就是一个细胞，

每一行代表一个细胞，每一列的数值784～10229代表每个特定的PMT的荧光信号强度值；

两个PMT作为横纵坐标，可以根据荧光强度判定这两种荧光抗体结合细胞的比例；

一个细胞在轴上就是一个点，每一个点就代表一个细胞的位置，横纵坐标分别代表两个通道PMT的强度（选取的两个PMT）；

从下图可以看到黑乎乎的一团代表一种细胞，但具体的数字并不知道，为了弥补这个缺点呢，就出现了密度图

细胞越多用不同的颜色（伪色）表示，可以看到红色中心的细胞最多，外周细胞少

把密度相等的点画成一条线

横轴代表荧光信号强度，纵轴代表细胞数量

流式细胞术的用途是什么

细胞或者其他颗粒状的物体可以被荧光标记的抗体或者替他荧光染料染色。当这些被标记的物体通过流式细胞仪的时候，激光照射，得到不同的激发光。

用途：1.

临床诊断：比如白血病，淋巴瘤的分型，可以指导治疗。检测干细胞的百分率，可以判断干细胞治疗的效果等等

2.

实验研究。根据前面所说的原理。只要可以被染色的，都可以用流式来分析。可以检查各种抗原的含量。代谢状态等等。

3.

细胞的分选。最后，根据染色的状态，可以把不同的细胞筛选出来，进行下一步的研究。

流式细胞术，你这磨人的小妖精

流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。

一、小妖精的成仙之路

二、样本类型

流式细胞仪可检测多种样本：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、微生物。

三、工作原理

流式细胞仪主要由3部分组成：液流系统、光学系统、电子系统。进行荧光染色后的待测细胞会在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下待测细胞呈单行排列，依次通过检测区域，被荧光染色的细胞在激光束的照射下会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管( PMT) 接收。接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

四、流式细胞术的应用

五、操作过程中的注意点

1、上机前处理

小心荧光淬灭

操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办？可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。

注意染色顺序

在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。

选好染色方案

染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。（考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。）

做好阴性对照及同型对照试验

细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。

同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。

选择合适的抗体

通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。

2、参数设定

数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。

电压

电压的调节需根据阴性对照管来调节。

阈值

可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值；大多数样本都可以设定FSC/SSC；阈值以下的信号不存储；可以根据阴性对照管来调节。

目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。

补偿

流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。

补偿方式：任意两个通道之间都可以调节。

补偿的调节：根据单染对照管来调节。

六、数据分析

流式细胞仪分析细胞的各种参数都是通过光信号来实现的。光信号包括了散射光信号和荧光信号。散射光信号包括前向角散射（FSC，反应细胞的大小）和侧向角散射（SSC，反应细胞颗粒度）。荧光信号可以用来反应细胞的抗原表达等化学特性。

流式图的种类非常多，最常用的是流式直方图和流式散点图。

直方图

流式直方图只能显示一个通道的信息。

横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。

散点图

X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。

FSC和SSC是流式中两个非常基本的参数，FSC的值能代表细胞的大小，细胞的体积越大，其FSC就越大。SSC则代表细胞的颗粒度，细胞内细胞器和颗粒度越大，则SSC越大。分析外周血细胞时，就可以利用FSC和SSC的特性把细胞分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞（左图）。

右图中可以看到X轴为CD3，Y轴为CD4，四个象限表示：左上是CD3-CD4+，左下是CD3-CD4-，右上是CD3+CD4+，右下是CD3+CD4-。

等高线和密度图

等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。

密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞越少。

三维图