肿瘤干细胞成球实验方案（肿瘤干细胞成球实验方案设计）

各位大神 肿瘤干细胞成球实验怎么做啊？求protocol啊

成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法。其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我aht艺术植发更新的能力，一般用细胞球形成效率（Sphere

Formation Efficiency,

SFE）表示。对于某些肿瘤如胶质瘤和乳腺癌，它们的肿瘤干细胞在体外条件培养时相对较容易形成细胞球，而另一些上皮肿瘤如肝癌、结肠癌等则相对成球困难

些。

为了28岁掉发严重还会生长吗促进细胞的成球生长，近些年人们开始使用低粘附的培养板防止细胞贴壁，结合使用无血清培养基（加入B27和合适浓度的生长因子等添加剂，各种肿瘤报道的不尽相同，需要参考相关文献），以及使用1%浓度的甲基纤维素（methyl cellulose）抑制细胞聚集以确保一个细胞球来源于单个细胞等，建立了一套新的方法，获得了不错的效果。目前该方法已经在多种肿瘤干细胞的研究中得到应用。

SFE的计算方法：

使用上述方法培养10-14天以后，即可计算直径大于75um的细胞球的个数。

SFE=每孔中直径大于75um的细胞球的个数 / 每孔中原始接种细胞的总数

细胞球的传代：

通常情况下，我还需要检测细胞连续传代后的自我更新能力，此时就需要进行细胞球的传代。方法是，过70μm的细胞筛收集培养10-14天后的细胞球，使用胰酶消化成单细胞，将合适数量的细胞铺入96孔板继续进一步培养10-14天，统计细胞球的个数，计算SFE。

摘自：SenduraiA. Mani, Wenjun Guo,

Mai-Jing Liao, Elinor Ng. Eaton, Ayyakkannu Ayyanan,Alicia Y. Zhou, Mary

Brooks, Ferenc Reinhard, Cheng Cheng Zhang, MichailShipitsin, Lauren L.

Campbell, Kornelia Polyak, Cathrin Brisken, Jing Yang, andRobert A.

Weinberg. The Epithelial-MesenchymalTransition Generates Cells with Properties of Stem Cells. Cell. 2008; 133:704–715.

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细胞增殖

增殖是一种在生物医学领域内， 非常常见的表型， 甚至可以说是最常见的一种表型。

细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征。 高等动物体内的细胞，主要有两种增殖的方式。第一种是体细胞的增殖方式： 有丝分裂。 有丝分裂也是最常见的一种增殖方式。 在有丝分裂的过程中， 2 倍体的体细胞在经过有丝分裂之后， 产生两个都是 2 倍体的后代细胞；另一种是性生殖细胞所采用的增殖方式， 被称为减数分裂。 减数分裂最大的特点是， 2倍体的性生殖细胞， 经过减数分裂后， 形成 2 个单倍体的后代细胞。 由于细胞在分裂前是 2 倍体， 而分裂后变成了单倍体， 使得细胞内的染色体数目变成了原先的一半， 因此得名“减数分裂” 。

增殖是最为常见的表型。 无论是正常生理条件下， 还是异常的病理条件下， 无论是正常的细胞， 还是异常的细胞， 增殖现象都是普遍存在的。

一.增殖表型如何检测？

1.分子层面检测增殖表型

有些分子的表达和增殖的表型有密切的关系， 因此， 只要能检测到这些特定分子的表达， 就表征了增殖现象的发生。 这类分子就是增殖的 marker 分子。

常见的和增殖相关的 marker 分子有如下几种：

（1） 与增殖相关的分子标志物

A) MCM （微小染色体维持蛋白， minichromasome maintenance protein， MCM） 。 MCM只存在于真核细胞中。 MCM 在有丝分裂的晚期和 G1 期与染色质紧密结合， 在 S 期和G2 期分开。 MCM 蛋白只在细胞的增殖期才能检测到， 它的表达在 G1/S 转换点达到峰值， 在分化期和静息期时， 表达缺失， 因此可以作为细胞增殖的特殊标志物。

B) 细胞核相关抗原 Ki-67。 这个分子是经典的细胞增殖相关分子标志物， 最早在 1983年在增殖细胞中发现， 目前在病理诊断中使用非常地广泛。 Ki-67 的一级结构比较特殊，还没有发现与之同源的蛋白， 所以目前对于 Ki-67 的功能了解得不多。 推测它可能具有如下的几个功能： 1） 推测 Ki-67 可以调节细胞周期； 2） Ki-67 能和 DNA 或者 RNA 发 生相互结合； 3） Ki-67 在细胞分裂期参与合成核糖体。 Ki-67 在细胞的 G0 期不表达，G1 中期到后期出现表达， S 期和 G2 期表达逐渐增加， 有丝分裂期达到高峰， 细胞分裂后迅速降解。

C) 增殖细胞核抗原 PCNA。 PCNA 又称为周期素， 它是 DNA 聚合酶δ的辅助蛋白。 这个分子也是经典的增殖相关分子标志物， 最早在 1978 年就有所报道。 又因为 PCNA 出现在增殖期细胞的细胞核中， 所以被称之为增殖细胞核抗原。 PCNA 的主要功能有： 1）DNA 聚合酶δ的辅助蛋白； 2） 参与 DNA 损伤的修复； 3） 参与细胞周期的调控； 4）和 p21 相互作用。 P21 是 CDK 的抑制因子， 因此 PCNA 通过和 p21 相互作用， 间接影响细胞周期和增殖。 在增殖细胞的细胞周期中， PCNA 的量会发生明显变化， 它在 G0/G1期几乎没有表达， G1 晚期表达大幅度增加， S 期达到高峰,G2/M 期表达下降。 PCNA 也已经广泛应用于临床病理诊断和相关的生物学研究中。

PCNA 和 Ki-67 作为细胞增殖标志物， 所存在的一些缺陷。 PCNA 和 Ki-67在 G1 早期不表达， 因此在整个细胞周期过程中， 存在表达时间上的间隙。 另外 PCNA 在DNA 修复和复制过程中， 发挥了作用， 这会导致结果的“假阳性”。 就是说某些没有发生增殖， 但是发生了 DNA 修复的细胞， 也会上调 PCNA 的表达， 这会让研究者误以为细胞发生了增殖。 Ki-67 也会有类似假阳性现象的存在， 比如说 Ki-67 的表达水平， 会受到外部因素的影响， 比如在营养缺乏的时候。 MCM 蛋白相对于 PCNA 和 Ki-67 而言， 很大的优势在于整个细胞周期中都有表达， 而且它不受 DNA 损伤修复和其他瑜伽几岁开始学比较好外部因素的影响。 因此有的研究者认为， MCM 蛋白是优于 PCNA 和 Ki-67 的理想的细胞增殖标志物。 但是从实际的应用层面看， 无论是在临床应用当中， 还是在基础科研当中， PCNA 和 Ki-67 的应用， 都更加广泛。

（2） 和干细胞相关的分子标志物

根据肿瘤干细胞的理论， 肿瘤干细胞是肿瘤中， 具有自我更新的能力并且能够产生异质性的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖， 维持了肿瘤细胞群的生命力。 因此， 如果通过肿瘤干细胞相关分子标志物的检测， 证实肿瘤干细胞的数量增加， 这就提示肿瘤的恶性程度高， 间接地说明了肿瘤增殖能力的增强。 例如， CD44 是胰腺癌中肿瘤干细胞常用的分子标志物， 因此可以通过检测 CD44 的表达水平， 证实胰腺癌中肿瘤干细胞的情况， 间接地证实肿瘤细胞增殖能力的强弱。 但是采用这种方法是具有局限性的， 因为不同肿瘤的肿瘤干细胞分子标志物是不同的。 而且在很多肿瘤当中， 肿瘤干细胞的标志物， 还存在很大的争议。所以我个人的建议是， 直接检测 PCNA 或者 Ki-67 之类的细胞增殖相关标志物更好更直接；检测肿瘤干细胞相关的分子标志物， 只能间接地说明肿瘤细胞的恶性增殖情况， 只能算是锦上添花而已。

（3） 检测抑癌基因

检测抑癌基因相关的分子标志物也是一类和细胞增殖间接相关的分子标志物。检测这一类分子标志物， 它存在着如下的一种逻辑推理的过程， 首先， 在细胞内抑癌基因的表达水平或者活性明显下降， 就提示肿瘤的恶性程度明显提升， 间接地说明了肿瘤的恶性增殖表型会有所增加。 在这一类分子标志物当中常见的抑癌基因有两个： p53 和 PTEN。 经常可以看到在论文当中， 通过 western 或者 qPCR， 证实 p53 以及 PTEN 分子表达水平降低， 从而间接地说明肿瘤细胞恶性程度上升， 肿瘤的增殖表型也会显著的提升。

2.细胞层面检测增殖表型

（1） 直接检测细胞的增殖状态

A） 最为经典的方法是 MTT 法。 MTT 是一种染料。 它的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。 DMSO 能溶解细胞中的甲瓒， 最后用酶标仪在特定的波长处， 测定光吸收值， 可间接反映活细胞的数量。 MTT 法早已成为研究细胞增殖的经典方法。 后续基于类似的实验原理，还在 MTT方法的基础之上，演化出了各种不同的替代技术，比如 CCK8染色实验等等。 在做 MTT 实验的时候， 通常取 5 个时间点（通常就是 5 天） 。 把 5 天中每一天的吸光度数据都记录下来， 最后形成一条细胞增殖的曲线。 通过比较不同处理方式或者不同实验组之间， 细胞增殖曲线的高低， 就可以判断细胞增殖情况的快慢。

B） 另一种经常用于检测细胞增殖的经典方法是 Brdu 染色法。 Brdu 是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的 DNA， 可以代替胸腺嘧啶， 选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。 这种渗入可以稳定存在， 随着 DNA 的复制， Brdu 可以进入子代细胞中。 Brdu 特异性抗体可以用于检测 Brdu 在细胞 DNA 中的渗入， 从而判断细胞增殖能力的变化。 通常在使用 Brdu 单克隆抗体之后， 都会结合免疫荧光染色， 显示增殖的细胞， 同时结合其他细胞标记物， 进行双重染色， 可以判断增殖细胞的种类， 增殖细胞的增殖速度， 对研究细胞动力学有重要的意义， 因为组织细胞内没有内源性 Brdu 的存在， 所以这种方法用于检测细胞的增殖， 应用非常广。 另外， 通过 Brdu 染色法可以提供影像学相关的数据， 这比单纯采用MTT 法（只能提供简单的折线图） ， 要更富有视觉效果。 基于 Brdu 染色方法， 又演化迭代出 Edu 的染色方法。 Edu 也是一种胸腺嘧啶核苷类似物， 能够在 DNA 复制时期代替胸腺嘧啶， 渗入正在合成的 DNA 分子中。 而且在检测的时候， 直接采用荧光染料与 Edu 特异性反应， 直接准确地检测出 DNA 复制活性， 能更有效地检测细胞增殖现象。

C) MTT 法或者 Brdu 染色法， 这类技术都属于 End-point assay（终点分析法） 。 因为这类技术对于细胞都有破坏作用， 在检测过程中， 细胞已经死亡， 结构也不再完整。 因此， 有公司（例如罗氏） 研发了实时记录细胞增殖状态的设备和方法， 这种设备成为 RTCA（real time cell analyzer， RTCA） 。 RTCA 这类技术的特点就是实时（real time） 。 RTCA 实时细胞分析仪， 需要用到特定的细胞培养板（被称为 E-plate） ， 在 E-plate 每一个孔的底部都含有特制的电极。 电极的作用就是实时记录孔内的电阻抗（electric impedance） 。 当细胞在孔内发生粘附， 转移， 增殖的时候， 孔内的电阻抗发生变化， 被电 极实时记录， 研究者也就获得了相关的实时数据。 不过需要特别强调的是， 采用这种 RTCA的方法， 不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取， 也可以用来检测细胞的黏附， 细胞的凋亡、细胞的转移等等， 所以它的应用范围是非常广的。

（2） 检测细胞的克隆形成能力

肿瘤细胞由于恶性程度高， 因而还具有一类特殊的增殖能力--被称为克隆形成能力。 正常细胞在增殖的时候， 需要细胞与细胞之间的信号传递。 这些信号的存在， 使得正常细胞增殖过程中， 可以有序地受到调控。 但是肿瘤细胞具有高度的恶性， 它的增殖是不受调控的， 所以即便缺少细胞之间的交互和信号通路， 肿瘤细胞也可以由单独一个细胞， 增殖形成大量的子代细胞， 最终形成一个细胞克隆。 这种现象就被称之为克隆形成能力， 可以通过克隆形成实验， 加以检测。

对于干细胞， 也有一种类似于克隆形成实验的技术， 用于检测干细胞的增殖能力， 这种方法被称为“干细胞悬浮成球试验” （microsphere formation assay） 。 鉴定干细胞需要很多的指标， 能在离体条件下， 形成微球/悬浮球（microsphere） 是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。

3.组织层面检测增殖表型

（1） 检测分子标志物

临床上最容易获得的组织样本， 通常都是石蜡切片。 基于石蜡切片， 可以进行免疫组织化学IHC 的研究， 检测和增殖相关的分子标志物， 比如 PCNA 和 Ki-67。

（2） 细胞形态和组织结构上的差异

在临床组织样本当中， 除了检测和增殖表型相关的分子标志物之外， 还可以通过形态学的方式， 检测细胞形态的多样性和组织结构上的巨大差异。

通过石蜡切片的染色实验， 可以观察到恶性肿瘤细胞一般比正常细胞要大。 而且即便是同一种肿瘤， 在相同的组织部位， 肿瘤细胞的大小和形态也会很不一致， 很不均匀， 有时甚至会出现巨细胞。 在有些肿瘤细胞的细胞核内， 会出现细胞核体积增大的现象， 这就使肿瘤细胞的细胞核与细胞浆的比例异常。 肿瘤细胞的细胞核大小， 形状都很不均一， 甚至会出现巨核、双核、 多核或者是形态奇异的奇异型细胞核。 通过详细的形态学观察可以判定细胞发生了恶性增殖。

正常组织当中， 是由很多不同类型的细胞所组成。 不同类型的细胞在组织内， 以特定的、 有序的排列顺序， 组成了健康的组织。 但是在组织内发生肿瘤之后， 由于肿瘤细胞发生不受控制的恶性增殖， 并且挤压了周围的正常细胞， 导致整个正常组织内细胞的有序排列顺序被破坏， 组织内不同类型细胞的排列结构发生异常。 通过对于组织内部细胞排列顺序和排列结构的检测， 也能够获得肿瘤细胞发生恶性增殖的证据。

4.动物层面检测增殖表型

大部分的疾病类型都有与之相对应的， 可用于研究的动物模型。 在肿瘤研究当中， 用于研究增殖相关表型的动物模型， 最常见的就是移植瘤动物模型。

在移植瘤当中， 为了获取和增殖相关的表型， 通常要记录几个参数， 比较简单的有肿瘤的大小也就是体积， 其次是肿瘤的重量， 这些参数是反应肿瘤大小和细胞增殖特性， 最直观的数据。 有了移植瘤的样本之后， 我们还是可以通过降低维度的方式， 以移植瘤的样本作为检测对象， 检测分子标志物以及检测细胞相关的行为学和形态学。

二.总结

靶向肿瘤干细胞——治疗癌症新策略！

在过去的20多年里，随机模型是癌症发生的主流观点。按照随机模型，正常体细胞中原癌基因和抑癌基因发生随机突变，从而获得更强的增殖能力、分化抑制和克隆选择，最终导致癌症发生。

随机突变模型认为，肿瘤中的每个细胞具有均等的形成新肿瘤的能力，肿瘤起源于克隆。但另一个学说，即癌症干细胞理论也得到业界不少人的认可。

癌度将为您简要介绍癌症干细胞理论的发展历程、来源和检测方法。

癌症干细胞概念的发展历程

对癌症发病机制的探索可以追溯到古希腊时代，第一个已知的癌症发生理论由Hippcrates、Celsius和Galen提出。基于疾病的体液本质，他们推测癌症是由多余的“黑胆汁”所导致。

直到19世纪中叶，干细胞作为癌症前体的概念才首次被提出。病理学家Cohnheim在前人研究的基础上正式提出了癌症的“胚胎残留”假说，认为肿瘤来源于残留的胚胎而不是成体组织，这个理论构成了现代癌症干细胞概念的基础。

与“胚胎残留”假说并行发展的另一个关于癌症克隆进化的假说也迅速在科学界流行起来。

1871年，Knudson提出了癌症的“双重打击”学说，揭示了遗传性与非遗传性癌症的基础。5年以后，Nowell提出癌症发展是通过一系列、逐步获得的基因突变和更具侵袭性克隆的连续选择而实现。

19世纪后半叶和20世纪初，癌症的克隆进化理论盛行，胚胎残留理论很少被提及，直到1960年干细胞生物学的复兴。在一系列具有里程碑意义的实验中，Pierce发现畸胎瘤中的多能干细胞同样出现在肿瘤的胚状体中，他的发现使得癌症发生的胚胎残留理论得以复兴。

20世纪末期，实验医学的重大技术进步促进了多项技术的发展，包括放射自显影的放射性标记技术、商业化的荧光激活细胞分选、明确验证的细胞表面标记、小鼠异种移植实验和检测HSCs的高速多通道流式细胞术。

首先是发现了血液癌症中存在干细胞群的证据，即白血病干细胞的发现；然后是在实体瘤中，2003年的一篇具有里程碑意义的文献中，乳腺癌的细胞异质性被发现。随后更多的研究者报道了癌症干细胞存在于结肠癌、肝癌、肺癌和前列腺癌中。

癌症干细胞的来源

癌症干细胞被认为来源于正常组织干细胞或者更分化的细胞群的转化。这些细胞在应对突变事件或免疫反应中发生了去分化，从而获得了类似干细胞的特征。在实体瘤中，干细胞表型的获得可以通过上皮-间充质转化（EMT）来实现。

为了理解癌症来源于正常组织干细胞，我们先来看三个概念。

成体干细胞是增殖率极低的分裂静止的细胞，具有自我更新和分化能力，是成体组织的来源。

祖细胞分化程度比成体干细胞高，它具有一定的分化特征和有限的自我更新能力，最终形成特定的分化细胞。

癌症干细胞和成体干细胞有很多相似之处，且成体组织干细胞与祖细胞都有转化成癌症干细胞的能力。

大多数癌症中，细胞中的一个突变是导致这种转化的起始事件，原癌基因突变引起随后的多重打击将在一段时间内造成突变的积累，最后导致癌症干细胞失去调控的扩增。在血液癌症和实体瘤中，科学家发现了大量证据说明癌症干细胞来源于成体干细胞和祖细胞。

癌症干细胞的检测方法

癌症干细胞研究的最大挑战是其在肿瘤中比例低，有研究表明其比例不足肿瘤细胞总数的5%，这就给检测带来了难题。

癌症干细胞的检测手段包括荧光激活细胞分选（FACS）、免疫磁珠分选、细胞表面标志物的免疫组织化学（IHC）分析以及肿瘤微球形成实验。

FACS是最广泛使用的分离和富集癌症干细胞的方法，该技术既可以用于分析血液癌症，又可以用于实体瘤研究。其主要有两种方式，一是分析细胞表面标志物，二是检测“侧群”细胞。

常见肿瘤中癌症干细胞的免疫表型特征见表1所示。当然，流式细胞技术仍然存在一些缺陷，它需要分析足够多的非粘连细胞才能获得具有统计学意义的癌症干细胞数目，癌症干细胞本身数量不足制约了该技术的应用。

表1 常见肿瘤中癌症干细胞的免疫表型特征

肿瘤微球形成实验的方法是将癌细胞以低密度接种在半液态无血清非黏附培养基中，几周内形成肿瘤微球，再联合免疫缺陷的小鼠，尤其是缺乏T细胞和B细胞的SCID小鼠。对这些小鼠进行不定期的检查以观察肿瘤的形成，进一步将潜在的干细胞分离和鉴定出来。

癌症干细胞生物学中的信号通路

一个正常组织干细胞转化成癌症干细胞需要积累多个基因突变、表观遗传变化和信号通路失控，研究最多的是Notch、Hh和Wnt/β-catenin信号通路。

Notch信号通路对细胞与细胞之间的信息通信非常重要，它通过调控干细胞增殖、分化和细胞死亡调控胚胎发育和成体稳态的维持。

一方面Notch信号促进T细胞前体细胞的增殖、生存和分化；

另一方面抑制B细胞前体细胞的生长并能诱导凋亡。

Wnt蛋白的主要功能是调控一系列器官系统的发育，Wnt基因转录表达上调会引发干性、细胞增殖、EMT和侵袭的行为。

Hh信号在胚胎发育中起到非常重要的作用，也负责干细胞群体在成体中的维持。Hh通路的突变导致信号持续激活可以引发肿瘤形成，这在基底细胞癌和成神经管细胞瘤中得到了公认，在其他多种癌症中也观察到了该信号的不正常激活。Hh信号通路也被发现可以调控癌症干细胞的增殖并能增加肿瘤的侵袭能力。

干细胞微环境是指非上皮的间质组织所形成的独特微环境，干细胞存在其中。癌症干细胞也存在于具有类似支持功能的微环境中，称之为癌症干细胞微环境。癌症干细胞与其所处的微环境之间复杂的相互作用可以调控干细胞的干性、增殖以及抵抗凋亡。

微环境提供了合适的空间保证癌症干细胞的自我更新、使其产生分化程度更高的细胞，同时保持未分化的状态。

微环境保护癌症干细胞免受遗传毒性伤害，增加其化学药物耐受和放射耐受能力。

微环境通过引起肿瘤中非癌症干细胞的去分化以及诱导EMT的发生，来促进肿瘤的进展和转移。

这些在骨髓、皮肤、神经、胃肠道、结直肠中发现了大量的证据。

癌症干细胞对放化疗耐受，主要是由于其具有细胞周期缓慢、增值率低、DNA修复和抗凋亡基因表达水平较高等特征，使得放化疗等针对活跃增殖的癌细胞的方法失效，而且癌症干细胞与不良预后相关，所以很有必要发展针对癌症干细胞的治疗方法。

靶向癌症干细胞的新疗法

靶向癌症干细胞的治疗可以从多方面设计：诱导癌症干细胞分化、抑制干细胞状态的维持、靶向癌症干细胞的微环境等。

靶向诱导癌症干细胞分化的治疗是通过诱导CSC失去自我更新能力损耗癌症干细胞池来制约肿瘤的进展。诱导分化的药物包括维A酸、BMP、组蛋白去乙酰化酶抑制剂等，很有希望作为实体瘤传统放化疗辅助手段应用于临床。

通过靶向信号通路而抑制干细胞状态的维持主要包括针对Notch、Hh和Wnt等药物，目前已经进入人体临床阶段。抑制Notch信号通路的两个药物罗氏的RO4929097和默克的MK0752进入临床I期。靶向Hh通路的著名药物是基因泰克（GDC-0449）。

靶向癌症干细胞的微环境主要是抗血管生成抑制剂，比如贝伐、索拉非尼、舒尼替尼和依维莫司等。

癌度有话说

以肿瘤发生为基础的癌症干细胞假说在过去20年里成为了研究焦点。大量的实验证据支持这一假说，也由于一些尚未解决的问题在癌症生物学家中存在争论。其中最主要的争论涉及癌症干细胞的来源、动物模型数据和人体数据的差异以及肿瘤中存在的癌症干细胞数量等问题。

不管如何，癌症干细胞假说模型解释了一个长期存在的关于化疗治疗肿瘤的困扰，即化疗导致最初的临床和病理缓解，但随后可能会发生更具侵袭性和耐药性的复发和转移的难题。

因此，针对癌症干细胞为靶点的治疗有望解决这一难题，癌度也希望未来有更多更好的研究和药物造福肿瘤患者。

编者：飞宇

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