间充质干细胞成骨诱导试剂盒（骨髓间充质干细胞培养基怎么配）

本文目录一览：

• 1、骨髓间充质干细胞三系诱导分化技术
• 2、免疫组化鉴定骨髓间充质干细胞买什么试剂盒
• 3、间充质干细胞成骨/成软骨/成脂诱导分化-迪医明生物
• 4、请教间充质干细胞成脂诱导分化培养基的配制
• 5、干细胞诱导-迪医明生物

骨髓间充质干细胞三系诱导分化技术

1.1 接种干细胞

取对数生长期的细胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的细胞密度接种至培养器皿，于37°C,5%CO2培养环境下培养至汇合度90~100%，弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液。NOTE:如细胞贴壁性较差，建议使用0.1%明胶对培养底面进行包被。

1.2 细胞分化诱导

于37°C, 5%CO2培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基维持液，培养1天后，再更换为成脂诱导分化培养基诱导液，继续培养3天。按照以上换液频率诱导14~21天,并注意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

2. 染色鉴定

2.1 细胞固定

吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面,室温固定30~60min,弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。

2.2 油红0染色

取生理盐水或1xPBS与油红O原液配制油红0工作液(油红0原液:生理盐水=3:2)，现用现配。配制后可对油红0工作液进行离心，以沉淀染色液中的过饱和析出物。向清洗干净的诱导孔内加入适量油红0工作液,静置染色30min。吸走油红0工作液，用1xPBS清洗两次，并加入适量1xPBS避免细胞干燥。

2.3 诱导评估

显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，脂滴与油红0染料结合后呈现红色或橘红色。NOTE:干细胞的成脂分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

1. 细胞分化诱导

将对数生长期的细胞消化下来计数，成软骨诱导分化培养基诱导液重悬细胞，离心后调整细胞密度密度1.0~2.0x 10e7cells/mL。吸取20 μl细胞悬液(约2.0~4.0x 10e5个细胞)悬滴至24孔板中央。置于37°C， 5%CO2培养环境下培养2~3 h使细胞贴壁。2~3 h后补充1 mL成软骨诱导分化培养基诱导液正常培养。每隔2~3天换液一次。按照以上换液频率诱导21~28天，并注意观察细胞形态变化。

2. 染色鉴定

2.1 细胞固定

吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去.后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~60min后，弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。

2.2 阿利辛蓝染色

向清洗干净的诱导孔内加入适量染色液，避光静置染色30min。吸去阿利辛蓝染色液，用1xPBS清洗两次,并加入适量1xPBS避免细胞干燥。

2.3 诱导评估

显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

1. 干细胞的准备

将对数生长期的细胞消化下来计数，取3x 10e5个细胞转移到15mL离心管中，250g离心4 min。弃上清,加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基预混液，重悬细胞，150g 离心5min。小心弃去.上清，加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基诱导.液，重悬细胞，150 g离心5 min。将15 mL离心管的管盖稍稍旋开，放置于37°C，5% CO2培养环境下培养。

2. 细胞分化诱导

24h后观察细胞沉淀形变团聚的情况，如有明显的变化，则小心轻柔地拨动管底，尝试让细胞团脱离管底，全部浸润在诱导液中。

置于37°C, 5% CO2培养环境下培养约21天，通常每2天更换一次新鲜配制的成软骨诱导分化培养基诱导液。注意观察细胞团成球情况及表面光滑度，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

3. 染色鉴定

3.1 软骨球固定

将软骨球从离心管中转移至EP管,并使用1xPBS清洗两次，最后置于适量的4%中性甲醛溶液中。

3.2 石蜡包埋切片

软骨球经石蜡包埋后切片。

3.3 阿利辛蓝染色

将石蜡切片脱蜡和脱水，使用阿利辛蓝染色液染色30 min，用自来水冲洗2 min,蒸馏水冲洗1次。

3.4 诱导评估

显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

NOTE:干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异

1.1 明胶包被培养器皿

干细胞培养较长时间后，可能会出现脱壁卷边或漂浮现象，建议使用0.1%明胶溶液对培养器皿进行包被。准备合适的培养器皿，取适量明胶覆盖底面37°C静置30 min,吸取晾干即可使用。

1.2 接种干细胞

取对数生长期的细胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的细胞密度接种至包被后的培养器皿中,于37°C，5%CO2培养环境下培养至汇合度60~70%，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基。

1.3 细胞分化诱导

于37°C, 5%CO2培养环境下培养约14~21天，每2~3天换液一次，并注意观察细胞形态变化。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况,决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

2. 染色鉴定

2.1 细胞固定

吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~ 60 min,弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。

2.2 茜素红染色

加入适量茜素红染色液染3~5 min,吸走茜素红染色液，用1xPBS清洗两次，并加入适量1xPBS避免细胞干燥。

2.3 诱导评估

显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，钙质结节与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。

NOTE:干细胞的成骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

免疫组化鉴定骨髓间充质干细胞买什么试剂盒

目前来说，直接鉴定骨髓间充质干细胞的存在并无公认的方法和统一的标准。其表面没有专属特异性的表达因子。

国内外的文献总结，MSC表达CD44+,CD105+,CD166+，CD34-，CD45-, CD73-等。但是外泌体载药量有文献认为CD271+为MSC，也有的认为c-kit-Sca1+是MSC。

所以，你免疫细胞存储公司的这个问题很难回答，但是你可以就上面所述的因子，查一下相关文献。

此外，问题中，大鼠组织块里，如何有骨髓MSC，请问什么组织中？你的骨髓MSC是打入组织中，然后再鉴定吗？如果是如此，建议你采用荧光染料染色后的MSC打入组织，或者GFP表达的MSC，这样可以通过免疫荧光方法来鉴定组织中发荧光的细胞就是MSC。

如果你还有疑问可以联系:zrjia2006@126.com

间充质干细胞成骨/成软骨/成脂诱导分化-迪医明生物

①  间充质干细胞诱导成骨常见问题：问题1　什么东东叫做矿化结节？

问题2　为什么我外泌体pkh26多少小时诱导的成骨，结节辣么少？

问题3　为什么我的细胞分布不均匀？

问题4 Oh My God，我的结节掉没了，咋办？

问题5　成骨诱导，怎样才算诱导成功了？

问题6　这么多种茜素红染液，PH值都五花八门的，我该选哪一种？

问题7　同样都是茜素红，为毛我的染不上色？

②间充质干细胞诱导成软骨常见问题：问题1 What is micromass ？

问题2 What is pellet ？

问题3　想要做出一个合格的软骨球，我需要提前准备啥？

问题4　如何形成一个合格的软骨球？

问题5 Hello~我成球了，然后怎么处理呢？

③间充质干细胞诱导成脂常见问题：

问题1　诱导成脂21天了，为什么木有出现脂肪液滴？

问题2　还木有染色，我的液滴咋就掉没了？

问题3　细胞铺下去好好的，怎么中间突然就秃了？

问题4　成脂诱导，怎样才算诱导成功了？

问题5　油红O染色为啥辣么任性，时间短了染不上；时间长了，背景全是渣滓，怎么破？

已经开学了，老板催实验结果，该咋办？本公司为专业细胞公司，从事干细胞研发工作多年，擅长间充质干细胞和iPS细胞的建库、培养体系研发、诱导试剂盒的开发以及细胞功能验证，帮助数以百计科研单位和个人论文顺利发表和结果验证。

下面两张图是迪医明生物的成脂、成骨、成软骨诱导结果展示：

由于Deeming从事干细胞研究工作数年之久，深知干细胞诱导工作中的盲点和痛点，对间充质干细胞培养以及干细胞成脂、成骨、成软骨诱导分化具有非常丰富的经验，目前也在为一些科研院所和个人提供不同类型干细胞培养和诱导分化的技术指导与服务，欢迎各位老师在干细胞培养和三系分化时遇到问题与迪医明生物联系，我们一起交流和成长。

请教间充质干细胞成脂诱导分化培养基的配制

充质干细胞成脂诱导分化培养基的配制

诱导液？你说的是成骨诱导条件培养基吧。

5天后半量换液，第10天当观察到少量细胞变为梭形、贴壁，即全量换液，改为条件培养基。此后每3-4天换1次条件培养基。倒置显微镜隔日观察，直至细胞不能传代、衰老死亡为止。

下面就是爬片的制作，染色以及结果判定了。

诱导培养基添加必要的成分使组织切块或细胞形成愈伤组织,分化培养基指把促使愈伤组织细胞恢复全能性,可以进行正常的根茎叶的形成

干细胞诱导-迪医明生物

间充质干细胞属于成体干细胞，在体外不同条件下诱导分化为骨、软骨及其他结缔组织，因其来源广泛，分离无创伤，较低的免疫原性、生长周期短等特点，是组织工程种子细胞的重要来源。干细胞的诱导分化一方面是干细胞鉴定的主要方法，另一方面也是干细胞功能学研究的主要途径。采用体外条件培养基诱导培养下，人间充质干细胞应能够分化为成脂肪、骨、软骨细胞。成脂分化经油红O染色法鉴定，成骨分化经茜素红染色法鉴定，成软骨分化经阿尔辛蓝染色法鉴定。

迪医明生物不仅可以提供不同来源间充质干细胞、iPS细胞，配套培养含血清和无血清培养体系以及诱导成脂、成骨、成软骨完全培养基、三系分化染色鉴定试剂盒，特别推荐您选择间充质干细胞技术服务项目——成脂、成骨、成软骨诱导技术指导和诱导实验外包服务。

迪医明生物干细胞系列产品检测结果表明，细胞无细菌、真菌、霉菌、支原体和病毒污染，表达多种间充质干细胞特异性标记，具有良好的增殖和分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。

产品性能

1.细胞形态

2. 细胞表型

间充质干细胞P20代细胞表型

流式细胞仪鉴定细胞表型

3.细胞诱导分化

3.1 成脂、成骨、成软骨诱导分化操作步骤

所需材料

0.05%Trypsin-0.02%EDTA（货号：CD05-001C）

Phosphate-BufferedSaline (1×PBS) （货号：BS01-001C）

间充质干细胞完全培养基（货号：CM01-001A）

间充质干细胞成脂诱导分化完全培养基（货号：DM01-001B）

间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基（货号：DM02-001B）

间充质干细胞成软骨诱导分化完全培养基（货号：DM03-001B）

成脂诱导分化步骤

注意：本操作规程以六孔板为例

1. 将间充质干细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。

2. 当细胞生长到达对数期时，用0.05%Trypsin-0.02%EDTA进行消化。

3. 将消化下来的间质干细胞按照2×104 cells/cm2的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。

4. 将细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。

5. 每隔三天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合。

6. 小心地将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL间充质干细胞成脂诱导分化培养基 A 液。

7. 诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液。

8. 24h后，吸走B液，换回A液进行诱导。

9. A液和B液交替作用3-5次后（12-20天），继续用 B 液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆。B 液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液。

成脂（油红O染色） 成骨（茜素红染色）

成骨诱导分化步骤

注意：本操作规程以六孔板为例

1. 将间充质干细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。

2. 当细胞融合度达到80-90%时，用0.05%Trypsin进行消化。

3. 将消化下来的间充质干细胞按照2×104 cells/cm2 的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。。

4. 将细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。

5. 当细胞融合度达到60%-70%时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基。

6. 每隔3天换用新鲜的间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基（使用前需预热至37℃）

7. 诱导2-4周后，视细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。

注意：为防止成骨细胞脱落，建议成骨过程中出现大量钙结节之后，换液形式变为每两天一次半量换液。

成软骨诱导分化步骤

1. 进行成软骨诱导实验之前，需要对常规消化后的细胞进行计数。

2. 将3-4×105个细胞转移到15 mL离心管中，250 g离心4 min。

3. 吸去上清，加入0.5 mL预混液，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗间充质干细胞，室温下150 g离心5 min。

4. 重复步骤3，再次清洗细胞。

5. 将上一步所得沉淀用0.5 mL间充质干细胞成软骨诱导完全培养基重悬。

6. 室温下150 g离心5 min。

7. 拧松 离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。

注意：

① 此步骤不要吸掉上清和重悬细胞。

② 24 小时之内不要摇动离心管。

8. 当细胞团出现聚拢现象时（一般为24 h或48 h后，实际视细胞生长情况而定）轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。

9. 自接种开始计算，每隔2-3 d 给细胞换用新鲜的成软骨诱导完全培养基，每管约0.5 mL成软骨诱导分化完全培养基。

注意：小心操作，不要吸出软骨球。

10.换液之后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。稍加拧松离心管盖放入37℃，5% CO2的培养箱中继续诱导培养。

11.一般持续诱导21-28天后，可对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋切片，最后进行阿利辛蓝染色。

成软骨（阿利新蓝染色）