肿瘤干细胞悬浮成球试验（干细胞悬浮成球实验）

本文目录一览：

• 1、细胞增殖
• 2、解螺旋24型-第1型增殖
• 3、各位大神 肿瘤干细胞成球实验怎么做啊？求protocol啊
• 4、请问有关肿瘤干细胞成球实验和动物成瘤实验的步骤?

细胞增殖

增殖是一种在生物医学领域内， 非常常见的表型， 甚至可以说是最常见的一种表型。

细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征。 高等动物体内的细胞，主要有两种增殖的方式。第一种是体细胞的增殖方式： 有丝分裂。 有丝分裂也是最常见的一种增殖方式。 在有丝分裂的过程中， 2 倍体的体细胞在经过有丝分裂之后， 产生两个都是 2 倍体的后代细胞；另一种是性生殖细胞所采用的增殖方式， 被称为减数分裂。 减数分裂最大的特点是， 2倍体的性生殖细胞， 经过减数分裂后， 形成 2 个单倍体的后代细胞。 由于细胞在分裂前是 2 倍体， 而分裂后变成了单倍体， 使得细胞内的染色体数目变成了原先的一半， 因此得名“减数分裂” 。

增殖是最为常见的表型。 无论是正常生理条件下， 还是异常的病理条件下， 无论是正常的细胞， 还是异常的细胞， 增殖现象都是普遍存在的。

一.增殖表型如何检测？

1.分子层面检测增殖表型

有些分子的表达和增殖的表型有密切的关系， 因此， 只要能检测到这些特定分子的表达， 就表征了增殖现象的发生。 这类分子就是增殖的 marker 分子。

常见的和增殖相关的 marker 分子有如下几种：

（1） 与增殖相关的分子标志物

A) MCM （微小染色体维持蛋白， minichromasome maintenance protein， MCM） 。 MCM只存在于真核细胞中。 MCM 在有丝分裂的晚期和 G1 期与染色质紧密结合， 在 S 期和G2 期分开。 MCM 蛋白只在细胞的增殖期才能检测到， 它的表达在 G1/S 转换点达到峰值， 在分化期和静息期时， 表达缺失， 因此可以作为细胞增殖的特殊标志物。

B) 细胞核相关抗原 Ki-67。 这个分子是经典的细胞增殖相关分子标志物， 最早在 1983年在增殖细胞中发现， 目前在病理诊断中使用非常地广泛。 Ki-67 的一级结构比较特殊，还没有发现与之同源的蛋白， 所以目前对于 Ki-67 的功能了解得不多。 推测它可能具有如下的几个功能： 1） 推测 Ki-67 可以调节细胞周期； 2） Ki-67 能和 DNA 或者 RNA 发 生相互结合； 3） Ki-67 在细胞分裂期参与合成核糖体。 Ki-67 在细胞的 G0 期不表达，G1 中期到后期出现表达， S 期和 G2 期表达逐渐增加， 有丝分裂期达到高峰， 细胞分裂后迅速降解。

C) 增殖细胞核抗原 PCNA。 PCNA 又称为周期素， 它是 DNA 聚合酶δ的辅助蛋白。 这个分子也是经典的增殖相关分子标志物， 最早在 1978 年就有所报道。 又因为 PCNA 出现在增殖期细胞的细胞核中， 所以被称之为增殖细胞核抗原。 PCNA 的主要功能有： 1）DNA 聚合酶δ的辅助蛋白； 2） 参与 DNA 损伤的修复； 3） 参与细胞周期的调控； 4）和 p21 相互作用。 P21 是 CDK 的抑制因子， 因此 PCNA 通过和 p21 相互作用， 间接影响细胞周期和增殖。 在增殖细胞的细胞周期中， PCNA 的量会发生明显变化， 它在 G0/G1期几乎没有表达， G1 晚期表达大幅度增加， S 期达到高峰,G2/M 期表达下降。 PCNA 也已经广泛应用于临床病理诊断和相关的生物学研究中。

PCNA 和 Ki-67 作为细胞增殖标志物， 所存在的一些缺陷。 PCNA 和 Ki-67在 G1 早期不表达， 因此在整个细胞周期过程中， 存在表达时间上的间隙。 另外 PCNA 在DNA 修复和复制过程中， 发挥了作用， 这会导致结果的“假阳性”。 就是说某些没有发生增殖， 但是发生了 DNA 修复的细胞， 也会上调 PCNA 的表达， 这会让研究者误以为细胞发生了增殖。 Ki-67 也会有类似假阳性现象的存在， 比如说 Ki-67 的表达水平， 会受到外部因素的影响， 比如在营养缺乏的时候。 MCM 蛋白相对于 PCNA 和 Ki-67 而言， 很大的优势在于整个细胞周期中都有表达， 而且它不受 DNA 损伤修复和其他外部因素的影响。 因此有的研究者认为， MCM 蛋白是优于 PCNA 和 Ki-67 的理想的细胞增殖标志物。 但是从实际的应用层面看， 无论是在临床应用当中， 还是在基础科研当中， PCNA 和 Ki-67 的应用， 都更加广泛。

（2） 和干细胞相关的分子标志物

根据肿瘤干细胞的理论， 肿瘤干细胞是肿瘤中， 具有自我干细胞美容保养的利弊更新的能力并且能够产生异质性的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞通过自我吃哪些食物有助于头发生长更新和无限增殖， 维持了肿瘤细胞群的生命力。 因此， 如果通过肿瘤干细胞相关分子标志物的检测， 证实肿瘤干细胞的数量增加， 这就提示肿瘤的恶性程度高， 间接地说明了肿瘤增殖能力的增强。 例如， CD44 是胰腺癌中肿瘤干细胞常用的分子标志物， 因此可以通过检测 CD44 的表达水平， 证实胰腺癌中肿瘤干细胞的情况， 间接地证实肿瘤细胞增殖能力的强弱。 但是采用这种方法是具有局限性的， 因为不同肿瘤的肿瘤干细胞分子标志物是不同的。 而且在很多肿瘤当中， 肿瘤干细胞的标志物， 还存在很大的争议。所以我个人的建议是， 直接检测 PCNA 或者 Ki-67 之类的细胞增殖相关标志物更好更直接；检测肿瘤干细胞相关的分子标志物， 只能间接地说明肿瘤细胞的恶性增殖情况， 只能算是锦上添花而已。

（3） 检测抑癌基因

检测抑癌基因相关的分子标志物也是一类和细胞增殖间接相关的分子标志物。检测这一类分子标志物， 它存在着如下的一种逻辑推理的过程， 首先， 在细胞内抑癌基因的表达水平或者活性明显下降， 就提示肿瘤的恶性程度明显提升， 间接地说明了肿瘤的恶性增殖表型会有所增加。 在这一类分子标志物当中常见的抑癌基因有两个： p53 和 PTEN。 经常可以看到在论文当中， 通过 western 或者 qPCR， 证实 p53 以及 PTEN 分子表达水平降低， 从而间接地说明肿瘤细胞恶性程度上升， 肿瘤的增殖表型也会显著的提升。

2.细胞层面检测增殖表型

（1） 直接检测细胞的增殖状态

A） 最为经典的方法是 MTT 法。 MTT 是一种染料。 它的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。 DMSO 能溶解细胞中的甲瓒， 最后用酶标仪在特定的波长处， 测定光吸收值， 可间接反映活细胞的数量。 MTT 法早已成为研究细胞增殖的经典方法。 后续基于类似的实验原理，还在 MTT方法的基础之上，演化出了各种不同的替代技术，比如 CCK8染色实验等等。 在做 MTT 实验的时候， 通常取 5 个时间点（通常就是 5 天） 。 把 5 天中每一天的吸光度数据都记录下来， 最后形成一条细胞增殖的曲线。 通过比较不同处理方式或者不同实验组之间， 细胞增殖曲线的高低， 就可以判断细胞增殖情况的快慢。

B） 另一种经常用于检测细胞增殖的经典方法是 Brdu 染色法。 Brdu 是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的 DNA， 可以代替胸腺嘧啶， 选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。 这种渗入可以稳定存在， 随着 DNA 的复制， Brdu 可以进入子代细胞中。 Brdu 特异性抗体可以用于检测 Brdu 在细胞 DNA 中的渗入， 从而判断细胞增殖能力的变化。 通常在使用 Brdu 单克隆抗体之后， 都会结合免疫荧光染色， 显示增殖的细胞， 同时结合其他细胞标记物， 进行双重染色， 可以判断增殖细胞的种类， 增殖细胞的增殖速度， 对研究细胞动力学有重要的意义， 因为组织细胞内没有内源性 Brdu 的存在， 所以这种方法用于检测细胞的增殖， 应用非常广。 另外， 通过 Brdu 染色法可以提供影像学相关的数据， 这比单纯采用MTT 法（只能提供简单的折线图） ， 要更富有视觉效果。 基于 Brdu 染色方法， 又演化迭代出 Edu 的染色方法。 Edu 也是一种胸腺嘧啶核苷类似物， 能够在 DNA 复制时期代替胸腺嘧啶， 渗入正在合成的 DNA 分子中。 而且在检测的时候， 直接采用荧光染料与 Edu 特异性反应， 直接准确地检测出 DNA 复制活性， 能更有效地检测细胞增殖现象。

C) MTT 法或者 Brdu 染色法， 这类技术都属于 End-point assay（终点分析法） 。 因为这类技术对于细胞都有破坏作用， 在检测过程中， 细胞已经死亡， 结构也不再完整。 因此， 有公司（例如罗氏） 研发了实时记录细胞增殖状态的设备和方法， 这种设备成为 RTCA（real time cell analyzer， RTCA） 。 RTCA 这类技术的特点就是实时（real time） 。 RTCA 实时细胞分析仪， 需要用到特定的细胞培养板（被称为 E-plate） ， 在 E-plate 每一个孔的底部都含有特制的电极。 电极的作用就是实时记录孔内的电阻抗（electric impedance） 。 当细胞在孔内发生粘附， 转移， 增殖的时候， 孔内的电阻抗发生变化， 被电 极实时记录， 研究者也就获得了相关的实时数据。 不过需要特别强调的是， 采用这种 RTCA的方法， 不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取， 也可以用来检测细胞的黏附， 细胞的凋亡、细胞的转移等等， 所以它的应用范围是非常广的。

（2） 检测细胞的克隆形成能力

肿瘤细胞由于恶性程度高， 因而还具有一类特殊的增殖能力--被称为克隆形成能力。 正常细胞在增殖的时候， 需要细胞与细胞之间的信号传递。 这些信号的存在， 使得正常细胞增殖过程中， 可以有序地受到调控。 但是肿瘤细胞具有高度的恶性， 它的增殖是不受调控的， 所以即便缺少细胞之间的交互和信号通路， 肿瘤细胞也可以由单独一个细胞， 增殖形成大量的子代细胞， 最终形成一个细胞克隆。 这种现象就被称之为克隆形成能力， 可以通过克隆形成实验， 加以检测。

对于干细胞， 也有一种类似于克隆形成实验的技术， 用于检测干细胞的增殖能力， 这种方法被称为“干细胞悬浮成球试验” （microsphere formation assay） 。 鉴定干细胞需要很多的指标， 能在离体条件下， 形成微球/悬浮球（microsphere） 是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。

3.组织层面检测增殖表型

（1） 检测分子标志物

临床上最容易获得的组织样本， 通常都是石蜡切片。 基于石蜡切片， 可以进行免疫组织化学IHC 的研究， 检测和增殖相关的分子标志物， 比如 PCNA 和 Ki-67。

（2） 细胞形态和组织结构上的差异

在临床组织样本当中， 除了检测和增殖表型相关的分子标志物之外， 还可以通过形态学的方式， 检测细胞形态的多样性和组织结构上的巨大差异。

通过石蜡切片的染色实验， 可以观察到恶性肿瘤细胞一般比正常细胞要大。 而且即便是同一种肿瘤， 在相同的组织部位， 肿瘤细胞的大小和形态也会很不一致， 很不均匀， 有时甚至会出现巨细胞。 在有些肿瘤细胞的细胞核内， 会出现细胞核体积增大的现象， 这就使肿瘤细胞的细胞核与细胞浆的比例异常。 肿瘤细胞的细胞核大小， 形状都很不均一， 甚至会出现巨核、双核、 多核或者是形态奇异的奇异型细胞核。 通过详细的形态学观察可以判定细胞发生了恶性增殖。

正常组织当中， 是由很多不同类型的细胞所组成。 不同类型的细胞在组织内， 以特定的、 有序的排列顺序， 组成了健康的组织。 但是在组织内发生肿瘤之后， 由于肿瘤细胞发生不受控制的恶性增殖， 并且挤压了周围的正常细胞， 导致整个正常组织内细胞的有序排列顺序被破坏， 组织内不同类型细胞的排列结构发生异常。 通过对于组织内部细胞排列顺序和排列结构的检测， 也能够获得肿瘤细胞发生恶性增殖的证据。

4.动物层面检测增殖表型

大部分的疾病类型都有与之相对应的， 可用于研究的动物模型。 在肿瘤研究当中， 用于研究增殖相关表型的动物模型， 最常见的就是移植瘤动物模型。

在移植瘤当中， 为了获取和增殖相关的表型， 通常要记录几个参数， 比较简单的有肿瘤的大小也就是体积， 其次是肿瘤的重量， 这些参数是反应肿瘤大小和细胞增殖特性， 最直观的数据。 有了移植瘤的样本之后， 我们还是可以通过降低维度的方式， 以移植瘤的样本作为检测对象， 检测分子标志物以及检测细胞相关的行为学和形态学。

二.总结

解螺旋24型-第1型增殖

一、增殖

表型的最大特点就是可以通过特定的实验手段进行检测

研究层次：人群→动物→组织→细胞→分子

1、分子层面：MCM，PCNA，Ki-67

①直接相关：免疫组化（最常用）PCNA、Ki67（较特异地存在增殖细胞中,但Ki67 G1期不存在，营养缺乏时表达上升；PCNA，由于“ DNA修复”误认为是“增殖” ）， PCNA、Ki-67、MCM（MCM最优） ；

微小染色体维持蛋白，minichromasome maintenance protein，MCM，只在细胞的增殖期才能够检测到，它的表达在 G1/S转换点达到峰值 ，在分化期和静息期时，表达缺失

Ki-67，细胞核相关抗原，在细胞的G0期不表达，G1中期到后期出现表达， S期和G2期表达逐渐增加，有丝分裂期达到高峰

PCNA，增殖细胞核抗原，周期素，参与DNA损伤的修复和间接参与细胞周期的调控，P21是CDK的抑制因子。在G0/G1期几乎没有表达，G1晚期表达大幅度增加， S期达到高峰 ,G2/M期表达下降。

②间接相关：检测肿瘤干细胞分子marker （如胰腺癌干细胞的CD44） ，存在争议，锦上添花；

拓展：干细胞检测实验 “干细胞悬浮成球试验”（microsphere formation assay）， 能在离体条件下，形成微球/悬浮球（microsphere），是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。

检测抑癌基因， 最常见P53，PTEN表达水平下降（western、qPCR） ，提示肿瘤恶性程度上升，增殖表型↑

2、细胞层面：

MTT法；原理：活细胞线粒体中的 琥珀酸脱氢酶 能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶 甲瓒（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。 二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，最后用酶标仪在特定的波长处，测定光吸收值，可间接反映活细胞的数量。在做MTT实验的时候，通常取5个时间点（通常就是5天）。把5天中每一天的吸光度数据都记录下来，最后形成一条细胞增殖的曲线。通过比较不同处理方式或者不同实验组之间，细胞增殖曲线的高低，就可以判断细胞增殖情况的快慢。

CCK8法：MTT衍生，原理类似

BrdU染色法；BrdU是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的DNA，可以代替胸腺嘧啶，选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。Brdu特异性抗体+免疫荧光染色可以用于检测Brdu在细胞DNA中的渗入，从而判断细胞增殖能力/动力（影像）的变化。

Edu染色法：；BrdU衍生，原理类似

RTCA法（real time cell analyzer），实时细胞分析仪，利用RTCA实时细胞分析仪，当细胞在孔内发生粘附，转移，增殖的时候，孔内的电阻抗发生变化，被电极实时记录，研究者也就获得了相关的实时数据。采用这种RTCA的方法，不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取，也可以用来检测细胞的黏附、凋亡、转移等等，应用范围广；

RTCA 是实时记录，实时记录的好处就是，不仅能够获得关键时间点的细胞增殖数据，而且还可以获得在整个培养周期内的细胞增殖动力学变化过程

克隆形成实验（不常用）：以评估肿瘤细胞的离体增殖能力的大小以及肿瘤在体外的致瘤能力的大小；

干细胞悬浮成球实验

3、组织层面：降低维度，回到细胞生物学和分子生物学层面免疫组化；形态学，检测细胞形态和组织结构上的差异。但是从总体而言， 从石蜡样本当中， 能够获得mRNA和蛋白的可能性很小，但是通过石蜡样本可以获得比较好质量的 DNA样本和miRNA样本 。！注意区分肿瘤区域和癌旁区域！存放于 深低温冰箱（-80 度） 中的新鲜组织样本只要保存方法合适，是可以从新鲜组织样本中获取蛋白，或者是mRNA/lncRNA样本，可以用于后续的 western实验或者qPCR 的实验。

4、动物层面：移植瘤动物模型，肿瘤大小、体积、重量 反映增殖最直观的数据；组织形态：移植瘤的中心部分形成部分组织和细胞的坏死，移植瘤恶性增殖程度越高，移植瘤内部形成坏死的区域也会愈加的明显。降低维度，匀浆后检测蛋白水平（western）、RNA（实时定量PCR）等；石蜡切片可获得高质量的DNA和miRNA样本， 注意区分肿瘤区域和癌旁区域。

有了动物模型的移植瘤样本之后，检测增殖相关的分子标志物，可以有多种方法。

第一种常见的方法是，把移植瘤的样本，通过匀浆的方式 抽提总的蛋白或者是总的RNA ，检测增殖相关的分子标志物蛋白水平的变化或者是RNA水平的变化。检测蛋白可以用western blot；检测RNA水平的变化，可以用实时定量PCR的方法。如果对于移植瘤样本，不进行匀浆，不抽提总蛋白或者总的RNA，而是对移植瘤样本进行组织切片，然后通过 免疫组化的方法，检测切片样本当中，PCNA 以及Ki-67 等增殖相关分子标志物 的表达变化，也能达到类似的效果。

在移植瘤的样本当中，还可以检测细胞的组织形态。因为肿瘤细胞会发生不受控制的恶性增殖，会导致移植瘤的中心部分，由于肿瘤细胞的密度过高，无法接触到外界的氧气和养分，会使移植瘤的中心部分形成部分组织和细胞的坏死。移植瘤恶性增殖程度越高，移植瘤内部形成坏死的区域也会愈加的明显。所以可以通过移植瘤的组织切片，检测移植瘤内部坏死区域的面积大小，评估肿瘤恶性增殖程度的强弱。

总结：

增殖是最常见的表型，可以从分子/细胞/组织/动物 四个层面上进行相关检测。

在分子层面上 ，常见的有三个PCNA，Ki-67 和MCM。还有两类和增殖间接相关的分子标志物：一类是干细胞相关的分子标志物；另一类是检测抑癌基因，但相对不太常用。

缺点：Ki67在G1期不存在，营养缺乏时表达上升；PCNA，由于“ DNA修复”误认为是“增殖”

在细胞层面上 ，常见的方法有：1）MTT 比色法；2）Brdu 染色法；3）RTCA（real time cell analyzer，实时细胞分析法），其中MTT比色法和Brdu染色法是经典方法，RTCA 对于硬件设备的要求很高，成本高昂。检测克隆形成，可以使用克隆形成实验（colony formation assay）。

MTT原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒。

RTCA不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取，也可以用来检测细胞的黏附、凋亡、转移等等，应用范围广。

在组织层面上 ，1）可以通过免疫组化的方法，检测增殖相关的分子标志物（PCNA，Ki-67 和MCM）；也可以取新鲜组织做western或qPCR，但注意区别肿瘤区域和癌旁区域；2）通过形态学，检测细胞形态和组织结构上的差异。

在动物层面上， 检测增殖表型最常用的动物模型是移植瘤动物模型，记录 移植瘤的大小 / 体积，重量等参数 。通过动物的移植瘤样本，同样可以检测增殖相关的 分子标志物 。另外，由于移植瘤中，细胞发生急剧的增殖，会导致移植瘤内部因为缺少氧气和养分而形成坏死区域，通过形态学检测移植瘤 内部的坏死区域，也是评估增殖的有效手段 。

各位大神 肿瘤干细胞成球实验怎么做啊？求protocol啊

成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法。其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力，一般用细胞球形成效率（Sphere

Formation Efficiency,

SFE）表示。对于某些肿瘤如胶质瘤和乳腺癌，它们的肿瘤干细胞在体外条件培养时相对较容易形成细胞球，而另一些上皮肿瘤如肝癌、结肠癌等则相对成球困难

些。

为了促进细胞的成球生长，近些年人们开始使用低粘附的培养板防止细胞贴壁，结合使用无血清培养基（加入B27和合适浓度的生长因子等添加剂，各种肿瘤报道的不尽相同，需要参考相关文献），以及使用1%浓度的甲基纤维素（methyl cellulose）抑制细胞聚集以确保一个细胞球来源于单个细胞等，建立了一套新的方法，获得了不错的效果。目前该方法已经在多种肿瘤干细胞的研究中得到应用。

SFE的计算方法：

使用上述方法培养10-14天以后，即可计算直径大于75um的细胞球的个数。

SFE=每孔中直径大于75um的细胞球的个数 / 每孔中原始接种细胞的总数

细胞球的传代：

通常情况下，我还需要检测细胞连续传代后的自我更新能力，此时就需要进行细胞球的传代。方法是，过70μm的细胞筛收集培养10-14天后的细胞球，使用胰酶消化成单细胞，将合适数量的细胞铺入96孔板继续进一步培养10-14天，统计细胞球的个数，计算SFE。

摘自：SenduraiA. Mani, Wenjun Guo,

Mai-Jing Liao, Elinor Ng. Eaton, Ayyakkannu Ayyanan,Alicia Y. Zhou, Mary

Brooks, Ferenc Reinhard, Cheng Cheng Zhang, MichailShipitsin, Lauren L.

Campbell, Kornelia Polyak, Cathrin Brisken, Jing Yang, andRobert A.

Weinberg. The Epithelial-MesenchymalTransition Generates Cells with Properties of Stem Cells. Cell. 2008; 133:704–715.

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请问有关肿瘤干细胞成球实验和动物成瘤实验的步骤?

质粒除了原核细胞有之外小鼠造血干细胞形成骨髓瘤细胞只是某些基因突变，此过程中基因发生了突变，比方说酵母菌，许多真菌中也含有，还有形成了新的mRNA和新的蛋白质，选择性表达的过程