干细胞提取方法（干细胞提取方法有哪些）

本文目录一览：

• 1、干细胞是calnexin外泌体阳性从哪里提取的？
• 2、怎样提取干细胞中的蛋白？
• 3、请教专家，怎样分离提取人精原干细胞？
• 4、干细胞疗法是什么东西啊？
• 5、人体干细胞如何提取?

干细胞是从哪里提取的？

干细胞是采集新生婴儿的脐带血，患者的外周血或患者骨髓血，通过专用的干细胞分离液、提闭指取、纯化后得到临床治疗所需要的干细胞。 脑瘫的治疗，年龄越小，再构成代偿能力越强，治疗的扒态链可能性就越大。28岁做干细胞移植治疗脑瘫的效果不敢保证，但一定程度上改善症状还是可以的春孙。

怎样提取干细胞中的蛋白？

你的问题我精原干细胞培养方法没学过，以下是我在网上找的，希望对你有用！

细胞内蛋白质的提取：

1、Trixon-100或NP-40裂毁罩解液裂解；

2、冻融裂解法；

3、研磨法；

“经典的就是分子克隆2讲的，用RIPA裂解，然后刮下来，冰裕30min，超生，4度离心10min”

（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4、每瓶细胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、裂解完后，用干净的刮棒首洞将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。

（2） 组织中总蛋白的提取：

1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、加400 μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3、用枪洗干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（二）蛋白含量的测定

（1） 制作标准曲线

1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

3、按下表在各管中加入各种试剂。

0μg 2.5μg 5.0μg 10.0μg 20.0μg 40.0μg

1mg/ml BSA － 2.5μl 5.0μl 10.0μl 20.0μl 40.0μl

0.15mol/L NaCl 100μl 97.5μl 95.0μl 90.0μl 80.0μl 60.0μl

4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。

（2） 检测样品蛋白含量

1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。

、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好者余枯标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。

（三） SDS－PAGE电泳

（1） 清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2） 灌胶与上样

1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）

2、配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） " S9 O. L+ `- T: E

3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了免费师范生最新政策。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）

测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过20μl，加样孔的最大限度可加25μl样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

（3） 电泳 电泳时间一般1-2 h，电压为80较好，也可用100。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

（四）转膜

（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）

将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60转移2 h或40转移3 h。 （6） 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。 / h3 P" o9 d8 n% U8 X. R

（五）免疫反应

（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。 （3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

（六）化学发光，显影，定影

将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

凝胶图象分析 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

请教专家，怎样分离提取人精原干细胞？

采用两种酶两步法分离培养人睾丸精原干细胞。方法先后应用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化法,Percoll密度梯度离心,差异贴壁法,进行人精原干细胞的分离及隐败棚培养;采用细胞免疫荧光法进行人精原干细胞的鉴定;流式细胞法对Oct-4标记阳性的细胞进行筛选,并同时检测所获精原干细胞的纯度,建立精原干细胞和支持细胞共培养体系。结果两种酶两步法消化的人睾丸细胞悬液活细胞率为91.07%,Percoll密度梯度离心结合差异贴壁离心纯化后的细胞经Oct-4细胞免疫荧光法检测表达阳性,流式细胞技术检测阳灶则性细胞所占比例为86.7%,该阳性细胞能够在支持细胞饲养层上稳定生长30 d。结论所获Oct-4表达阳性细胞为精原干细胞。Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步酶消化法是一种经济、简单易行、对细胞污染损伤少的分离培养人精原干细胞的方法,利用此方法分离的人精原干细胞能够在支持细胞饲养层上形枯灶成稳定集落。

干细胞疗法是什么东西啊？

简介

干细胞是能够长期存活，具有不断的自我繁殖能力和多向化潜能，几乎存在于所有组织中的原始细胞。干细胞疗法是将患者自己的骨髓中的干细胞通过细胞生物学方法提取出来，经过体外分离再将其移植入患者肝内，就象一粒粒种子种在其肝脏“土壤”中，经过一段时间发育、成熟就会变为行使肝脏功能的肝细胞，从而补充、修复受损或缺损的肝组织，达到改善肝脏功能的目的。

原理

干细笑伍胞疗法根据细胞与分子免疫学原理，诱发人体自身产生大量对乙肝病毒（HBV）具有免疫杀伤作用的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），对HBV进行精确性、特异性、靶向性、主动式攻击，杀灭体内HBV病毒

。方法是通过科技手段将病人体内的单个核败如细胞提取出来，用特殊方法在患者体外将其培养成为树突状细胞（DC），赋予其专杀乙肝病毒的抗原信息，再使其数量成千倍增多，成为专门攻击杀伤乙肝病毒的“细胞导弹”。这种特殊的“导弹”能精确“瞄准”乙肝病毒进行杀伤，却不会伤及正常的肝细胞。然后将这种负载抗原信息的DC细胞回输到患者体内，在患者体内形成大量针对乙肝病毒的免疫杀伤细胞（CTL），从而针对血液和肝细胞中的乙肝病毒产生主动性和靶向性攻击，迅速准确地杀灭乙肝病毒（包括变异病毒），使患者在短时间内康复。

优势

干细胞疗法：新技术打破肝病传统药物治疗耐药瓶颈，治疗中不使用任何药物。常规的西药和传统的中药是通过持续抑制乙肝病毒的复制、清除或减轻肝脏的炎症、坏死，而阻延疾病进展，但很难从根本上祛除病毒。“干细胞疗法”完全摆脱了单一的药物治病的概念，它是从人体内采集出单核细胞，进行体外特殊培养，使其发育成树突细胞并大量扩增后与效应肽或靶向肽结合，成为专门攻击杀伤病毒的“细胞导弹”。

请察升启采纳

人体干细胞如何提取?

分为多种干细胞的，如果是造血干细胞隐岁或骨髓间充质干细胞，最常用的，主要取骨髓，进行分离培养。如果是表皮干细亩让胞，这个只处于研究阶段，只要取1mm2的皮肤就够了，如果是其他成体干细胞，如胰腺干细胞，精原干细胞，迅携局乳腺干细胞等，也要在特定组织内分离。